Антиген esat 6 что это
Квантифероновый тест. Сравнение квантиферонового теста и Т-Спот. ПЦР-диагностика туберкулеза
Квантифероновый тест (QuantiFERON®-ТВ Gold) — это современный лабораторный тест, который позволяет выявить туберкулез в латентной (скрытой) и активной стадии.
* принимаем анализ ежедневно по предварительной записи
Туберкулез – опасное инфекционное заболевание, вызванное микобактериями туберкулеза. Микобактерии туберкулеза могут поражать все органы и системы организма, чаще страдают органы дыхания, поэтому выделяют две формы туберкулеза: лёгочная и внелёгочная. При лёгочной форме поражаются лёгкие и бронхи, при внелёгочной форме: пищеварительная система (чаще дистальный отдел тонкого кишечника и слепая кишка); мочеполовая система (почки, мочевыводящие пути, половые органы у женщин: матка, трубы, придатки, у мужчин: простата, яички); нервная система (головной, спинной мозг); опорно-двигательная система (кости, чаще поражается позвоночник, суставы); кожа, глаза и др.
Разберем по полочкам скрининговые специфические методы диагностики туберкулеза: на сегодняшний день существует 2 группы.
ОБРАТИТЕ ВНИМАНИЕ! ПЦР диагностика туберкулеза не подходит для скрининга выявления туберкулеза, т.к. для этого метода необходим материал из ОЧАГА предполагаемого туберкулеза.
ПЦР крови на микобактерию туберкулеза, будет положительна при туберкулезном сепсисе (заражение крови) и диссеминированном туберкулезе (самые тяжелые формы туберкулеза). В остальных случаях результат будет отрицательный, но это не означает, что человек не инфицирован туберкулезом.
ПЦР диагностика используется для быстрой диагностики открытых и закрытых форм туберкулеза, например у человека выставлен диагноз туберкулез легких, необходимо понять, опасен он для окружающих или нет, берется мокрота и определяется возбудитель в мокроте.
Поэтому данный метод не используется для скрининговой диагностики туберкулеза, т.к. он не может исключить или подтвердить факт инфицирования туберкулезом.
Результаты и обсуждение
Ранее нами был сконструирован штамм E.coli Rosetta 2 (DE3), содержащий рекомбинантную плазмиду pET36b (+) /p38 и продуцирующий химерный полипептид с молекулярной массой
25 % от общего содержания белков в клетке.
Спроектированный нами химерный ген esat6-cfp10 был синтезирован фирмой DNA 2.0 (США). Ген был клонирован в клетках E.coli BL21 (DE3) в составе вектора pJExpress401, обеспечивающего индуцируемую ИПТГ экспрессию этого гена под контролем промотора бактериофага Т5. Отобранные рекомбинантные клоны анализировали на продукцию целевого белка – химерного белка ESAT6-CFP10 с помощью электрофореза лизата клеток в 12 % ДСН-ПААГ. В исследованных рекомбинантных клонах наблюдался индуцируемый ИПТГ синтез полипептида с молекулярной массой
15 % от общего содержания белков в клетке. Один из отобранных клонов использовали как для наработки рекомбинантного химерного белка ESAT6-CFP10, так и для получения плазмиды, служившей в дальнейшей работе в качестве матрицы при амплификации синтетических генов белков ESAT6 и CFP10. Ампликоны генов белков ESAT6 и CFP10 по отдельности клонировали в составе экспрессирующего вектора pETm/cbd в клетках E.coli BL21 (DE3). В результате лигирования целевых синтетических генов с плазмидным вектором pETm/cbd встраиваемые ДНК «сшивались» с нуклеотидной последовательностью вектора, кодирующей целлюлозосвязывающий домен CBDCenA, с образованием химерных генов «cbd-cfp10» и «cbd-esat6». Получение рекомбинантных белков CBD-P38, CBD-ESAT6 и CBD-CFP10 в виде «сшитых» с CBDCenA химер обусловлено необходимостью увеличения сорбции рекомбинантных антигенов на полистирольном планшете за счёт полипептидной цепи CBDCenA, содержащей протяжённые гидрофобные участки, способствующие связыванию с гидрофобной поверхностью полистирола. На рисунке 1 представлены схемы структур полипептидов, кодируемых сконструированными химерными генами.
Рисунок 1
Signal: N-концевая лидерная аминокислотная последовательность сигнала секреции;
CBD: аминокислотная последовательность целлюлозосвязывающего домена эндоглюконазы А из Cellumonas fimi;
ESAT6: аминокислотная последовательность белка ESAT6 из M. tuberculosis;
CFP10: аминокислотная последовательность белка CFP10 из M. tuberculosis;
Mature P38: аминокислотная последовательность зрелого белка P38 из M. tuberculosis;
MCS: аминокислотная последовательность, кодируемая полилинкером вектора pET36b (+) ;
8xHis: С-концевая аминокислотная последовательность из 8-ми гистидиновых остатков.
В скобках указано количество аминокислотных остатков (а.a.), входящих в полипептид.
Во всех образцах сывороток крови (n=729) с помощью непрямого варианта ИФА были определены уровни IgG-антител (ПТА) против всех антигенов. C целью определения оптимального порогового значения был проведен ROC-анализ. На основании полученных данных были построены характеристические ROC-кривые, выбраны пороговые значения при фиксированной специфичности 80 %, и проведен анализ частоты выявляемости патологических результатов (> порогового значения). Результаты представлены в таблице 1. У 44 % здоровых лиц были обнаружены ПТА хотя бы к одному антигену. Из 275 больных ТБ с бактериовыделением лишь у 13,5 % результат ИФА ко всем исследуемым антигенам был отрицательным, в то время как у больных без бактериовыделения процент отрицательных результатов составил 30 %. Достоверные различия между группой БЛ с бактериовыделением и с БЛ без бактериовыделения вне зависимости от стадии ТБ процесса обнаружены при определении ПТА только к PPDN-3, CBD-P38 и CBD-CFP10 (p 0,05) по содержанию ПТА против ESAT6-CFP10 и CBD-CFP10. Для этих антигенов нет значимых различий и при сопоставлении БЛ с бактериовыделением (n=271) и БЛ без бактериовыделения (n=50). Следовательно, ESAT6-CFP10 и CBD-CFP10 могут использоваться для выявления ТБ инфицирования (в независимости от наличия клинических проявлений ТБ и наличия бактериовыделения). У лиц с заболеваниями нетуберкулезной этиологии также были обнаружены достоверные различия по сравнению с группой БЛ при определении ПТА к PPDN-3, ESAT6-CFP10 и CBD-CFP10 (p
Диагностика латентной и активной туберкулезной инфекции методом T-SPOT.TB
Возбудителем туберкулёза является микобактерия туберкулеза (МБТ, палочка Коха, Mycobacterium tuberculosis) – высокоустойчивый микроорганизм. В настоящее время описано около 150 видов микобактерий, но клинически значимыми признаны М. tuberculosis (более 90 % всех случаев туберкулезной инфекции), М. bovis (5 %) и М. africanum (около 3 % – главным образом среди населения стран тропической Африки).
Источником инфекции являются больные люди и животные. Наиболее распространен воздушно-капельный путь заражения, при котором возбудитель проникает в организм через верхние дыхательные пути, иногда через слизистые оболочки пищеварительного тракта или через поврежденную кожу.
Попадая в окружающую среду, возбудитель способен длительно сохраняться: в высохшей мокроте он выживают до 10 месяцев, на предметах, окружающих больного (белье, книги), – более 3 месяцев, в воде – более года, в почве – до 6 месяцев.
В настоящее время описаны следующие варианты развития ситуации после проникновения МБТ в организм человека:[1]
полная элиминация (удаление) возбудителя из организма;
развитие первичного туберкулеза (при быстром росте и размножении МБТ);
инфицирование, или “латентная туберкулезная инфекция” (ЛТИ),[2] – состояние стойкого иммунного ответа на антигены МБТ при отсутствии клинических проявлений активной формы туберкулеза.
Присутствующий в организме возбудитель способен не только длительно бессимптомно персистировать в организме, но при определенных обстоятельствах (интенсивное размножение МБТ на фоне малоэффективного иммунитета и т.д.) реактивироваться и вызвать развитие заболевания. В настоящее время установлено, что с момента инфицирования МБТ в течение первого года заболевание развивается у 5 % инфицированных людей, в течение всей оставшейся жизни туберкулез развивается еще у 5 %, то есть пожизненный риск заболевания туберкулезом среди инфицированных составляет 10 %.
Вместе с тем наличие различных факторов может способствовать повышению риска развития локального туберкулеза: так, при ВИЧ-инфицировании ежегодный риск заболевания туберкулезом на фоне ЛТИ составляет 10 %, а пожизненный риск – 50 %.
Диагностика туберкулеза является комплексной и включает, согласно регламентирующим документам,[3] аллергические внутрикожные пробы (реакция Манту и “Диаскинтест”), инструментальное обследование (ФЛГ, рентген) и лабораторные – направленные как на выявление и идентификацию возбудителя с определением спектра его чувствительности к препаратам этиотропной терапии, так и на изучение выраженности иммунологической реакции на патоген.
Одним из современных и высокоинформативных методов определения специфической иммунной реакции на МБТ, особенно при отсутствии или минимальных клинико-инструментальных признаках инфекции и сомнительных результатах общепринятых методов лабораторной диагностики туберкулеза, является тест T-SPOT.
Исследование иммунного Т-клеточно-опосредованного ответа: количественное определение в крови эффекторных Т-клеток (CD4 и CD8), вырабатывающих ИФН-ɣ (гамма-интерферон), который продуцируется в ответ на стимуляцию специально подобранными антигенами ESAT-6 и CFP10. Эти белки входят в состав клинически значимых МБТ (М. tuberculosis, М. bovis, М. africanum) и отсутствуют у бактерий, используемых при производстве вакцины БЦЖ и у непатогенных для человека микобактерий.
Преимущества теста Т- SPOT:
высокая специфичность и чувствительность метода (87-97 %);
безопасность, отсутствие побочных реакций;
отсутствие ложноположительных результатов;
результат исследования не зависит от наличия вакцинации БЦЖ;
не имеет противопоказаний и ограничений по времени проведения;
позволяет диагностировать внелегочные формы туберкулеза;
позволяет диагностировать инфекцию у пациентов с ВИЧ и низкими показателями уровня CD4.[4]
Для чего используется исследование?
Диагностика туберкулезной инфекции.
Когда назначается исследование?
Пациентам, у которых в связи с основным заболеванием (эпилепсия, хронические заболевания в стадии обострения и др.) затруднено проведение внутрикожных тестов.
При наличии в анамнезе пациента токсико-аллергических реакций на туберкулин.
Детям, привитым БЦЖ, у которых выявлена ложноположительная реакция Манту, – до проведения инструментального обследования легких.[5]
По эпидемиологическим показаниям – пациентам, прибывшим из стран с высоким уровнем заболеваемости туберкулезом (Африка, Азия) и/или находившимся в контакте с лицами с диагностированным заболеванием.
Пациентам с аутоиммунными и др. заболеваниями (силикоз), ведущими к снижению системного иммунитета.
Пациентам, получающим системное лечение глюкокортикоидами или иммуносупрессивную терапию.
Онкологическим пациентам, получающим лучевую и химиотерапию.
Пациентам на диализе или готовящимся к трансплантации органов или переливанию крови.
ВИЧ-инфицированным, особенно со снижением количества СD4-клеток.
При подозрении на внелегочные формы туберкулеза.
Не менее 3 часов после последнего приема пищи. Можно пить воду без газа. Исключить курение за 30 минут до сдачи анализа.
| Биологический материал | кровь (гепарин) |
|---|---|
| Метод исследования | энзим-связывающий иммуноспоттинг (ELISPOT) |
| Срок исполнения без учета времени на доставку до лаборатории, дней | 5 календарных дня Срок доставки в лабораторию с момента взятия биоматериала 6 ч. |
| Формат результата, единицы измерения | качественный |
Т-СПОТ антиген A (ESAT-6)
Менее или равный 4 – отрицательный; от 5 до 7 – пограничный, более или равный 8 – положительный
Т-СПОТ антиген B (ECFP-10)
Менее или равный 4 – отрицательный; от 5 до 7 – пограничный, более или равный 8 – положительный
Исследование позволяет провести косвенную диагностику наличия в организме возбудителя туберкулеза по интенсивности иммунологической реакции, но не дает возможность дифференцировать форму заболевания.
Трактовку результатов исследования необходимо проводить только в комплексе с эпидемиологическими и клинико-инструментальными данными обследования пациента.
Отрицательный результат исследования не гарантирует отсутствия инфицирования. У пациентов, находившихся в контакте с инфицированными МБТ, результаты исследования могут быть отрицательными. Рекомендуется проведение повторного исследования через 6 недель после контакта либо при появлении клинических признаков или симптомов, свидетельствующих о возможном заражении.
Положительный результат исследования не свидетельствует об активной форме туберкулеза. Для подтверждения диагноза необходимо проведение других исследований, включая культуральные исследования мокроты, ПЦР, рентгенографическое исследование грудной клетки и др.
Что может влиять на результат?
Результат исследования может быть недостоверен в связи с высокой спонтанной продукцией ИФН-y или недостаточной функциональной активностью Т-лимфоцитов. В таком случае рекомендовано повторить исследование через 2-4 недели.
Папула после Манту в редких случаях может влиять на результат, особенно усиливая пограничные результаты до слабых положительных значений или слабые положительные до просто положительных. Рекомендуется выдержать после снятия Манту хотя бы 72 часа. Если папула сильно выраженная, то лучше сделать перерыв в 1-2 недели, чтобы избежать ложноположительного результата.
Скачать пример результата
Важные замечания
Важно помнить, что Т-SPOT является способом количественной диагностики наличия в организме туберкулеза, но не дает возможности отличить активную форму туберкулеза от латентной.
Тест имеет особое значение в диагностике туберкулеза у носителей ВИЧ. Вирус иммунодефицита поражает как раз те клетки, которые используются для диагностики в любом из IGRA-тестов, к которым относится и T-SPOT, т.е. клетки CD4. В ходе исследований обнаружилось, что даже на поздних стадиях развития ВИЧ, когда количество лимфоцитов CD4 уже не превышает 100 на мм,3 выявляемость туберкулеза при помощи Т-SPOT остается очень высокой.
Антиген esat 6 что это
Универсальный альтернативный вариант иммунологического исследования in vitro диагностики туберкулезного процесса путем количественного определения мононуклеарных клеток периферической крови, продуцирующих ИФН-γ в ответ на присутствие белков CFP-10 и ESAT-6 M. tuberculosis.
Иммунологический тест на туберкулез
Синонимы английские
Testing for tuberculosis infection
Прямая оценка функции T-клеток энзим-связывающий иммуноспотингом (ELISPOT).
Зарегистрирован в РФ в 2012 г. (рег. УД. № ФСЗ 2012/648).
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Как правильно подготовиться к исследованию?
Общая информация об исследовании
Возбудителем туберкулёза является микобактерия туберкулеза (МБТ, палочка Коха, Mycobacterium tuberculosis) – высокоустойчивый микроорганизм. В настоящее время описано около 150 видов микобактерий, но клинически значимыми признаны М. tuberculosis (более 90 % всех случаев туберкулезной инфекции), М. bovis (5 %) и М. africanum (около 3 % – главным образом среди населения стран тропической Африки).
Источником инфекции являются больные люди и животные. Наиболее распространен воздушно-капельный путь заражения, при котором возбудитель проникает в организм через верхние дыхательные пути, иногда через слизистые оболочки пищеварительного тракта или через поврежденную кожу.
Попадая в окружающую среду, возбудитель способен длительно сохраняться: в высохшей мокроте он выживают до 10 месяцев, на предметах, окружающих больного (белье, книги), – более 3 месяцев, в воде – более года, в почве – до 6 месяцев.
В настоящее время описаны следующие варианты развития ситуации после проникновения МБТ в организм человека: [1]
Присутствующий в организме возбудитель способен не только длительно бессимптомно персистировать в организме, но при определенных обстоятельствах (интенсивное размножение МБТ на фоне малоэффективного иммунитета и т.д.) реактивироваться и вызвать развитие заболевания. В настоящее время установлено, что с момента инфицирования МБТ в течение первого года заболевание развивается у 5 % инфицированных людей, в течение всей оставшейся жизни туберкулез развивается еще у 5 %, то есть пожизненный риск заболевания туберкулезом среди инфицированных составляет 10 %.
Вместе с тем наличие различных факторов может способствовать повышению риска развития локального туберкулеза: так, при ВИЧ-инфицировании ежегодный риск заболевания туберкулезом на фоне ЛТИ составляет 10 %, а пожизненный риск – 50 %.
Диагностика туберкулеза является комплексной и включает, согласно регламентирующим документам, [3] аллергические внутрикожные пробы (реакция Манту и «Диаскинтест»), инструментальное обследование (ФЛГ, рентген) и лабораторные – направленные как на выявление и идентификацию возбудителя с определением спектра его чувствительности к препаратам этиотропной терапии, так и на изучение выраженности иммунологической реакции на патоген.
Одним из современных и высокоинформативных методов определения специфической иммунной реакции на МБТ, особенно при отсутствии или минимальных клинико-инструментальных признаках инфекции и сомнительных результатах общепринятых методов лабораторной диагностики туберкулеза, является тест T-SPOT.
Исследование иммунного Т-клеточно-опосредованного ответа: количественное определение в крови эффекторных Т-клеток (CD4 и CD8), вырабатывающих ИФН-ɣ (гамма-интерферон), который продуцируется в ответ на стимуляцию специально подобранными антигенами ESAT-6 и CFP10. Эти белки входят в состав клинически значимых МБТ (М. tuberculosis, М. bovis, М. africanum) и отсутствуют у бактерий, используемых при производстве вакцины БЦЖ и у непатогенных для человека микобактерий.
Преимущества теста Т- SPOT:
Для чего используется исследование?
Когда назначается исследование?
Обсуждение информативности различных методов оценки туберкулиновой сенсибилизации
Применение рекомбинантных Early Secretory Antigen Target-6 (ESAT-6) и Culture Filtrate Protein-10 (CFP-10) (точнее набора синтетических пептидов перекрывающих последовательности аминокислот + часть последовательности белка TB7.7.) в качестве тест-антигенов для оценки туберкулиновой сенсибилизации in vivo и in vitro в рекламных проспектах обозначается новой эрой туберкулинодиагностики, отправившей в прошлое традиционные кожные и инвитровые тесты с использованием старого коховского туберкулина (пробы Пирке и Манту) и очищенного белкового деривата туберкулина (PPD) Зайферт-Линниковой (проба Манту).
На самом деле, ESAT-6 (6-килодальтонный ранний секреторный целевой антиген), CFP-10 (10-килодальтонный белок из культурального фильтрата и TB7.7. – это парциальные иммунодоминантные антигены, содержащиеся во всех традиционных туберкулинах, в фильтратах культур микобактерий туберкулёза человеческого и бычьего типа и ряда нетуберкулёзных микобактерий (Mycobacterium kansasii, Mycobacterium szulgai, и Mycobacterium marinum). Гены ESAT-6 и CFP-10 довольно древние, и не известно, сколько видов микобактерий, обитающих в почве или на растениях или вызывающих атипичные микобактериозы у человека, их ещё не утратили в процессе эволюции.
Кажется, их нет у Mycobacterium avium, но главное – микобактерии БЦЖ, утратив во время 13-летней аттенуции блок генов RD1, потеряли и эти гены. В этом новизна новой туберкулинодиагностики – она выявляет преимущественно иммунный ответ на заражение человека микобактериями человеческого или бычьего типа (МБТ), но не ответ на вакцинацию БЦЖ.
Теоретически кажется, что это решение столетней проблемы. Разработан метод дифференциации ГЗТ, вызванной неонатальной вакцинацией БЦЖ, и ГЗТ, обусловленной инфекцией МБТ. Принципиально важное преимущество по специфичности, поскольку, диагностировав инфицирование, можно научно обосновано начать химиопрофилактику туберкулёза, как можно, раньше.
Однако, это иллюзорное представление. Ни проба Манту c PPD или с ESAT-6 и CFP-10 (Диаскин), ни три одобренных FDA инвитровых метода определения синтеза гамма-интерферона Т-лимфоцитами или числаТ-клеток, секретирующих этот цитокин [QFT-G, QuantiFERON-TB Gold In-Tube test (QFT-GIT) и T-SPOT.TB test (T-Spot)] не позволяют дифференцировать среди инфицированных так сказать «здоровых носителей» (которых 95%) 5% заражённых, переживающих латентный туберкулёз, который вот-вот может проявиться активным туберкулёзным процессом. То есть, несмотря на положительную пробу Манту с PPD-Линниковой или с Диаскином, диагноз латентного туберкулёза, требующий химиопрофилактики, остаётся клинико-эпидемиологическим.
В нескольких сотнях исследовательских статей, посвящённых новейшим методам туберкулинодиагностики, и в рекламе реагентов и приборов для их осуществления содержатся иллюзорные утверждения об их большей точности и чувствительности. Это не так. В недавно опубликованной работе, где я и В.А.Аксёнова фигурируем как соавторы, показано, что в ответ на PPD Т-лимфоциты как здоровых, но инфицированных подростков, а также больных активным лёгочным туберкулёзом, синтезируют в 2 – 3 раза больше гамма-интерферона, чем в ответ на эквимолярную концентрацию ESAT-6, и что уровень индукции синтеза интерферона в образцах крови больных туберкулезом в присутствии антигенов МБТ находится в обратной зависимости от распространенности и тяжести туберкулезного процесса. Иными словами, чувствительность применения в туберкулинодиагностике PPD выше как в пробе Манту, так и в реакции синтеза гамма-интерферона. Точность и воспроизводимость, если сравнивать тесты in vivo (Манту) с тестами in vivo (Диаскин), а тесты in vitro (PPD) с тестами in vitro (ESAT-6, CFP-10 и TB7.7), сходные. TB7.7 не может не вызывать бустер-эффект.