Антитела к гамма интерферону человека что это
Иммунитету в помощь. Почему организму нужен интерферон после прививки
В период вакцинации от COVID-19 у многих возникают разные вопросы: «Как мой организм перенесет прививку? Есть ли риск заболеть ОРВИ? Как защититься от коронавируса между приемами двух компонентов вакцины?» О препаратах, которые помогают не только бороться с вирусом, но и укреплять иммунитет, мы поговорили с Александром Карауловым, доктором медицинских наук, академиком РАН, заведующим кафедрой клинической иммунологии и аллергологии, заведующим лабораторией иммунопатологии ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И. М. Сеченова».
— Александр Викторович, как организм реагирует на введение вакцины?
— Фактически с помощью вакцины мы тренируем нашу иммунную систему для будущей встречи с возбудителем. Ученые подчеркивают, что примерно 3% населения переносят COVID-19 тяжело, у 0,3% возможно жизненно угрожающее течение заболевания. Причем если раньше мы видели, что тяжелое течение чаще встречалось среди пожилых и пациентов с сопутствующими заболеваниями, то сейчас большинство жизнеугрожающих состояний приходится на пациентов в возрасте от 40 до 60 лет. Только у 50% тех, кто перенес COVID-19, сформировались антитела.
Вакцинация защищает от инфицирования, а если оно все же происходит, то инфекция протекает в легкой форме. Однако поствакцинальный иммунитет у разных групп людей формируется неодинаково. Его формирование может быть замедлено у пожилых людей или пациентов со слабым иммунитетом, то есть у тех, у кого защитные силы организма ослаблены перенесенными или сопутствующими инфекциями, хроническими заболеваниями, стрессом, недостаточностью питания, экологией и т. д.
— Сейчас много говорят об интерферонах, о том, что они укрепляют иммунитет. Уже вышло множество исследований о применении препаратов этой группы при COVID-19, в России они вошли в стандарты оказания медпомощи. А как работают интерфероны при вакцинации?
— Интерфероны в нашем организме выполняют регулирующую функцию. Если говорить иносказательно, то интерферон — это регулировщик на перекрестке: он направляет иммунный ответ в правильное русло, таким образом содействуя выздоровлению. Это свойство интерферона отлично подходит и для подготовки к вакцинации, которая, по сути, также является иммунной реакцией организма, но не с целью выздоровления, а с целью более эффективной выработки антител против возбудителя заболевания.
— Как именно интерферон влияет на уровень выработки антител?
— Интерфероны способствуют активации иммунитета, усиливают продукцию и созревание клеток, которые запускают формирование качественного иммунного ответа. Препараты на основе интерферона можно применять до вакцинации, спустя несколько часов или на следующий день после введения вакцины. Только нужно понимать, что они не действуют мгновенно: это процесс, который потребует определенного времени. С учетом накопленного клинического опыта я бы рекомендовал, например, ректальную форму препарата интерферона в течение пяти дней до вакцинации или пяти дней после. Это может усиливать формирование иммунного ответа и препятствовать возможности заражения пациента другими заболеваниями, пока адекватный уровень антител на введение вакцины еще не выработан.
— А можно ли во время вакцинации заболеть ОРВИ или той же «короной»?
— Заболеть можно, потому что в этот момент вся энергия организма направлена, как я уже сказал ранее, на выработку антител: иммунитет формируется не с первого дня, это уже многократно озвучено. Конечно, есть риск получить другую или ту же инфекцию, от которой вы прививаетесь, если антитела еще не выработались. Чтобы этого не произошло, нужна профилактика. К сожалению, люди так устали от пандемии, что, сделав первую прививку, зачастую перестают даже носить маски. Но важно понимать, что любое заболевание в период вакцинации — это двойная нагрузка на организм. Поэтому нужно очень ответственно вести себя в этот период.
— В каких случаях, помимо вакцинации, можно использовать препараты интерферона во время эпидемии COVID-19?
— Прежде всего — в качестве профилактики гелем, мазью с интерфероном, которые наносятся на слизистую оболочку носа. По сути, это универсальное средство профилактики ОРВИ, эффективность которого доказана еще до пандемии коронавируса, во время ежегодных эпидемий гриппа. Гелевые основы обладают пролонгированным (длительным) профилактическим эффектом, их удобно наносить.
— А можно ли препаратами интерферона лечить COVID-19?
— Что касается лечения, то не могу не обратить внимание на важность применения именно ректальной формы интерферона: свечей. В этом случае организм, ослабленный болезнью, получает недостающий интерферон, необходимый для адекватного ответа инфекции, дополнительно в лекарственном препарате. Свечи оказывают системное действие на организм в целом, то есть интерферон, введенный ректально, может проникать во все органы и ткани, поражаемые вирусом. Сегодня мы столкнулись с огромным количеством нейродегенеративных осложнений COVID-19. Вирус легко проникает в органы центральной нервной системы, вызывая в них порой необратимые изменения. Благодаря ректальному введению интерферон, используя лимфатические пути, способен проникать в спинномозговую жидкость, препятствуя развитию опасных осложнений. Также он быстро доставляется в легкие — недаром он многие годы применяется при лечении пневмоний.
Исследования по применению интерферона при коронавирусе активно идут на Западе и в России. Мы практически ежемесячно получаем новые данные. Например, наши коллеги из Омского медицинского университета провели исследование с участием 140 больных COVID-19. 70 из них получали стандартную терапию, а еще 70 сочетали ее с ректальными суппозиториями «ВИФЕРОН» и гелем, то и другое регулярно применялось в течение 14 дней. По результатам исследования симптомы интоксикации у таких пациентов — головная и мышечная боль, слабость — прекращались на 2-8 дней раньше. Кашель исчезал к 5 дню от начала лечения, насморк регистрировали только в течение 3 дней, нарушение вкуса и обоняния пациенты переставали отмечать к четвертому дню от начала лечения, одышка прекращалась к третьему дню. У пациентов, которые не получали дополнительно интерферон, все симптомы заболевания держались статистически дольше.
Отмечу, что на начальных стадиях заболевания действительно работает правило «чем раньше, тем лучше». Раннее начало терапии интерфероном снижает показатель летальности и демонстрирует лучшие результаты терапии. Это подтвердили исследования наших китайских коллег, показавших, что если исходный уровень интерферона альфа возрастает, допустим, благодаря терапии, то, как правило, нас ждет благоприятный исход заболевания.
Антитела к гамма интерферону человека что это
Подбор эффективной иммунотерапии, контроль состояния врожденного иммунитета.
Определение биологической активности по защите монослоя клеточной культуры от ЦПД вируса.
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Как правильно подготовиться к исследованию?
Общая информация об исследовании
Интерферон (ИФН) – это собирательное название целого ряда соединений белковой природы, которые необходимы для защиты организма от инфекций, являются важнейшим составным звеном врожденного неспецифического иммунитета. При проникновении в организм вирусов или других патогенных веществ интерфероны активируют внутри- и внеклеточные механизмы, необходимые для устойчивости или подавления инфекции.
Интерферон-альфа (лейкоцитарный) считается основным, продуцируется лейкоцитами, синтезированными в ответ на вторжение патогенных микроорганизмов. Основные функции: противовирусная (препятствует делению вирусных частиц), активация естественных Т-киллеров иммунной системы, противоопухолевая (посредством снижения пролиферации клеток и активации их апоптоза).
Интерферон-бета (фибробластный) образуется в стимулированных фибробластах, выполняет сходные с интерфероном-альфа функции.
Интерферон-гамма (иммунный) синтезируется Т-лимфоцитами и естественными киллерами, также оказывает противовирусное и противоопухолевое действие, но его главной функцией является иммуномодулирующая (регулирует весь комплекс реакций иммунного ответа в ответ на вторжение микроорганизма).
После попадания вирусной частицы в организм его клетки начинают активную выработку интерферона. ИФН не обладает прямым противовирусным действием, но способен активировать клеточные процессы, которые блокируют деление и распространение вируса. Кроме того, индуцируются механизмы апоптоза пораженных клеток и защиты неинфицированных от возможного воздействия. Также интерфероны (преимущественно гамма) способствуют активации иммунной системы для борьбы с инфекцией и контролируют все каскады реакций, происходящих при этом.
В настоящее время препараты интерферона широко используются в медицине в качестве противовирусных средств, которые дают те же биологические эффекты, что и врожденные интерфероны, синтезируемые в организме.
Существует еще одна группа препаратов, называемых индукторами интерферона, как правило, поступающих извне; они способны стимулировать синтез и высвобождение собственных интерферонов и могут вызывать синтез какого-то определенного типа интерферона или всех сразу в зависимости от необходимых показаний к назначению.
Существует множество препаратов всех этих групп, которые несколько различаются по показаниям и целям назначения.
Также необходимо отметить наличие интерферонового статуса организма, оценка которого позволяет делать выводы о состоянии иммунной системы, ее потенциальных и резервных возможностях при острых или хронических инфекционных процессах. Оценка ИФН-статуса важна, так как препараты интерферона, его индукторы и иммуномодуляторы часто используются в терапии различных инфекционных заболеваний. ИФН-статус подразумевает определение биологической функциональной активности интерферонов типа I (альфа и бета) и типа II (гамма) и уровень биологически активного интерферона в крови с определением чувствительности к препаратам. Исследование помогает оценивать врожденную систему интерферонов в организме и при необходимости грамотно назначать соответствующую терапию.
Исследование биологической активности ИФН-статуса основано на определении противовирусного действия интерферонов в биологической тест-системе (состоит из культуры клеток и тестового вируса с его поражающим действием). В результате определяются следующие показатели:
Определение чувствительности к определенным противовирусным средствам, как правило, проводится совместно с оценкой ИФН-статуса и подразумевает определение индивидуальной восприимчивости организма к тому или иному препарату. Результаты исследования позволяют оптимально подобрать терапию в каждом конкретном случае и добиться максимально эффективного ответа на нее.
Показания к исследованию ИФН-статуса с определением чувствительности к препаратам:
Важно отметить, что результаты исследования необходимо оценивать в комплексе с данными клинической картины, анамнеза и других методов лабораторной и инструментальной диагностики. Интерпретация осуществляется только врачом в каждом клиническом случае индивидуально.
При некоторых заболеваниях, сопровождающихся подавлением синтеза эндогенных интерферонов, необходимо получать их в виде синтезированных лекарственных средств – препаратов интерферона. К таким заболеваниям можно отнести хронические вирусные гепатиты, герпетическую инфекцию, рассеянный склероз, онкологические заболевания, часто рецидивирующие инфекции и т.д. В зависимости от каждого конкретного случая в схему лечения заболеваний могут входить препараты интерферона-гамма.
Интерферон-гамма (иммунный) синтезируется Т-лимфоцитами и естественными киллерами, оказывает противовирусное и противоопухолевое действие, но главной функцией является иммуномодулирующая (регулирует весь комплекс реакций иммунного ответа в ответ на вторжение микроорганизма). Препараты ИФН-гамма (как и других типов ИФН) представляют собой вещества белковой природы, вследствие чего при длительном их применении организм может начать вырабатывать к ним антитела, рассматривая препарат в качестве чужеродного антигена. В связи с этим рекомендуется проводить анализ на определение в сыворотке пациента таких нейтрализующих антител, блокирующих действие препарата ИФН на клетку-мишень и, соответственно, нивелирующих его действие. Основным показанием к данному исследованию является снижение эффективности препаратов ИФН при их длительном применении. В процессе анализа исследуется образец сыворотки крови и ее способность нейтрализовать биологическое действие принимаемого препарата ИФН. Исследование позволяет определить наличие нейтрализующих антител качественно (определить их присутствие в крови) и количественно (выразить в нейтрализующих единицах их активность и способность препятствовать препарату воздействовать на клетки-мишени).
Исследование рекомендуется проводить пациентам, длительно получающим терапию препаратами интерферона-гамма в целях контроля эффективности лекарственных средств и своевременного пересмотра схемы лечения, если это будет необходимо по результатам проведенных лабораторных анализов.
Для чего используется исследование?
Когда назначается исследование?
Что означают результаты?
Оценка анти-ИФН-активности выражается в нейтрализующих единицах (НЕ).
Иммунотропные свойства анаферона и анаферона детского
Опубликовано в журнале:
«Антибиотики и химиотерапия», 2013, ТОМ 58, № 5-6, с. 17-23
Е. С. ЖАВБЕРТ, Ю. Л. ДУГИНА, О. И. ЭПШТЕЙН
Общество с ограниченной ответственностью «Научно-производственная Фирма «Материа Медика Холдинг», Москва
Препараты анаферон и анаферон детский, созданные на основе релиз-активных антител к интерферону гамма (Р-А антител к ИФН-гамма), эффективны в лечении целого ряда вирусных инфекций. В серии доклинических исследовании, проведенных в ведущих российских и зарубежных научных организациях, были выявлены иммуномодулирующие (иммунотропные) свойства препаратов, обзор которых представлен в настоящей статье. Анаферон и анаферон детский стимулируют гуморальный и клеточный иммунный ответ, повышают фагоцитарную активность нейтрофилов и макрофагов. Ключевым механизмом иммунотропного действия Р-А антител к ИФН-гамма является влияние на систему интерферонов, в частности на ИФН-гамма, и функционально сопряженных с ней цитокинов, приводящее к нормализации функциональной активности естественных факторов иммунной защиты и к усилению противовирусного действия. Благодаря широкому спектру иммунотропной активности препараты анаферон и анаферон детский более 10-ти лет успешно применяются в лечении и профилактике заболеваний, в основе которых лежат нарушения функционального состояния иммунной системы.
Ключевые слова: анаферон, анаферон детский,релиз-активные антитела к ИФН-гамма, иммуннотропная активность, иммуномодулятор противовирусный препарат.
Immunotropic Properties of Anaferon and Anaferon Pediatric
E. S. ZHAVBERT, YU. L. DUDINA, O. I. EPSTEIN
Materia Medica Holding, Ltd, Moscow
Anaferon and pediatric anaferon based a release-active antibodies to interferons-y (R-A antibodies to INF-y) proved to be efficient in the treatment of many viral infections. Immunomodulating (immunotropic) properties of the drugs were revealed in the preclinical studies at many Russian and foreign research medical institutions and are reviewed herein. Anaferon and pediatric anaferon stimulated the humoral and cellular immune responses and increased the neutrophie and macrophage activity. The crucial mechanism of the immunotropic action of R-A antibodies to IFN-y was shown to be bound with the effect on the system of interferons and particular IFN-y and conjugated cytokines, resulting in normalization of the functional activity of the innate factors of the immune defense and increasing of the antiviral action. The broad spectrum of the immunotropic activity provided the success of anaferon and anaferon pediatric for more than 10 years in the treatment and prophylaxis of the diseases associated with disorders in the immune system functional state.
Key words: anaferon, pediatric, release-active antibodies to INF-y, immunotropic activity, immunomodulators, antivirals.
Введение
В 2001 году на основе релиз-активных (РА) антител к ИФН-гамма специалистами компании ООО «НПФ «Материа Медика Холдинг» были разработаны препараты, влияющие на систему интерферонов: анаферон детский (РУ PN000372/01 от 31.05.2007, разрешен к применению у больных с 1 месяца) и анаферон (РУ PN003362/01 от 06.11.2009, разрешен к применению у больных с 18 лет). Р-А антитела к ИФН-гамма также являются компонентом нового эффективного противовирусного препарата эргоферон, зарегистрированного в 2010 году (РУ ЛСР-007362/10 от 29.07.2010).
Используемая в производстве препаратов субстанция антител к ИФН-гамма аффинно очищенных произведена в Великобритании в компании Angel Biotechnology Inc в полном соответствии с международными требованиями надлежащей производственной практики (GMP). Как и другие препараты релиз-активных (Р-А) антител, Р-А антитела к ИФН-гамма оказывают специфическое модифицирующее действие на антиген, к которому они выработаны. С помощью метода ядерно-магнитного резонанса было показано, что Р-А антитела к ИФН-гамма вызывают конформационные изменения в молекуле ИФН-гамма. В подтверждение данного феномена, в радиолигандных исследованиях in vitro было выявлено, что Р-А антитела к ИФН-гамма усиливают взаимодействие ИФН-гамма с его рецептором (количество ИФН-гамма связавшегося с рецептором). Кроме того, Р-А антитела к ИФН-гамма изменяют аффинность связывания ИФН-гамма с антителами к ИФН- гамма, что было обнаружено с использованием иммуносенсорного метода и метода иммуноферментного анализа [3, 4].
Целью настоящего обзора явился анализ данных экспериментальных исследований посвященных изучению иммунотропных свойств Р-А антител к ИФН-гамма (препараты анаферон и анаферон детский).
По заказу ООО «НПФ «Материа Медика Холдинг» было проведено 76 доклинических исследований фармакологической активности и безопасности препаратов Р-А антител к ИФН-гамма: 56 исследований в ведущих научных учреждениях России, в том числе в НИИ фармакологии СО РАМН, Волгоградском медицинском университете, ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор», НИИ гриппа РАМН и др., и 20 исследований в зарубежных научных институтах и контрактных организациях, в том числе в компании Apcis SA, Франция, университете Питтсбурга, США, компании Euroscreen, Бельгия, в государственном университете штата Юта, США, компании Cerep, Франция и др. В настоящее время идут и запланированы ряд новых исследований с целью углубленного изучения механизмов действия и эффектов препаратов.
Анаферон и анаферон детский давно и успешно используются в клинической практике для профилактики и лечения острых и хронических вирусных инфекций: гриппа, острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ), герпесвирусных инфекций и др. В доклинических исследованиях была доказана противовирусная эффективность Р-А антител к ИФН-гамма как при профилактическом, так и при лечебном применении в условиях экспериментального заражения животных РНК- (вирусы гриппа А/Н3Ю, А/Н3Ш, «птичий грипп» А/Н5Ш, несколько штаммов пандемического «свиного» гриппа А/Н1Ш) и ДНК- (вирус простого герпеса II типа, штаммы MS и EC) содержащими вирусами [5—7]. Клиническая эффективность и безопасность анаферона и анаферона детского была изучена при следующих инфекциях: грипп (вирусы гриппа А, В), ОРВИ (вызванные аденовирусом, респираторно-синцитиальным вирусом, коронавирусом, вирусом парагриппа, микоплазмой, а также микст-инфекцией); герпесвирусные инфекции (ветряная оспа, инфекционный мононуклеоз, генитальный герпес); острые кишечные инфекции вирусной этиологии (вызванные калицивирусом, коронавирусом, ротавирусом) и др. [8—14].
Ключевым механизмом действия Р-А антител к ИФН-гамма является влияние на функциональное состояние системы интерферонов, в том числе через систему естественных аутоантител к ИФН-гамма [15]. Влияние на систему интерферонов является триггерным механизмом, через который анаферон/анаферон детский вовлекают в реализацию своей фармакологической активности естественные факторы врожденного и приобретенного иммунитета (клеточный и гуморальный иммунитет, фагоцитарная активность нейтрофилов и макрофагов). В клинических исследованиях подтверждено наличие у препаратов Р-А антител к ИФН-гамма противовирусной и иммунотропной активности. Иммунотропные свойства препарата были отмечены при различных патологиях (ОРВИ, грипп, мононуклеоз, калицивирусная, коронавирусная, ротавирусная инфекция) как при профилактическом, так и при лечебном введении [15—19].
Способность препарата увеличивать количество ИФН-гамма, связывающегося со своим рецептором, позволяет сделать предположение, что Р-А антитела к ИФН-гамма увеличивают количество фукнционально активных рецепторов на клеточной мембране и, возможно, являются аллостерическим модулятором рецептора ИФН-гамма. Выявленный эффект нашел подтверждение и в клинических исследованиях препарата — анаферон детский увеличивал субпопуляцию лимфоцитов, экспрессирующих на клеточной мембране рецепторы к ИФН-гамма (СБ119+-лимфоциты) [20].
В экспериментальных исследованиях ex vivo было показано, что Р-А антитела к ИФН-гамма стимулируют продукцию ИФН-гамма. Важно отметить, что использование Р-А антител к ИФН- гамма не приводит к гиперпродукции ИФН-гамма. Так в условиях экспериментальной модели меланомы В-16 было показано отсутствие усиления роста и метастазирования на фоне курсового введения Р-А антител к ИФН-гамма крысам, что позволило сделать вывод об отсутствии гиперпродукции ИФН-гамма, так как известно, что данный цитокин приводит к увеличению метастазирования в легкие и резистентности клеток меланомы к терапии [21].
Механизмы иммунотропного действия Р-А антител к ИФН-гамма.
Материал и методы
Эксперименты проведены на 246 мышах (180 самцах и 66 самках) линии СВА, 25 мышах-гибридах F1 (CBAxC57Bl/6) и 36 мышах-самцах линии C57B1/6 массой 16-18 г. Препараты Р-А антител к ИФН-гамма вводили животным в виде водного раствора внутрижелудочно.
При проведении опытов по оценке влияние Р-А антител к ИФН-гамма на пролиферативную активность Т- и В-лимфоцитов в качестве источника материала была использована периферическая кровь 10 здоровых доноров в возрасте от 22 до 36 лет.
При исследовании влияния Р-А антител к ИФН-гамма на гуморальный иммунный ответ эксперименты были проведены на мышах-самцах линии СВА (16—18 г) и мышах-самцах линии C57B1/6 (16—18 г). Мышей иммунизировали минимальными дозами эритроцитов барана (ЭБ) [22] —5 х 10 6 /мышь (однократно внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл). Для моделирования иммуносупрессии мышам однократно внутрибрюшинно вводили циклофосфан в дозе 125 мг/кг (1/2 максимально переносимой дозы). Мышам линии СВА Р-А антитела к ИФН-гамма (n=36) и дистиллированную воду (контроль, n=36) вводили внутрижелудочно в дозе 0,2 мл/мышь в течение 5 дней. Исследования проводили на здоровых мышах, мышах с иммуносупрессией, иммунизированных мышах и иммунизированных мышах с иммуносупрессией. Введение ЭБ и циклофосфана осуществляли в первый день введения дистиллированной воды или Р-А антитела к ИФН-гамма. 6 мышей оставались интактными.
Мышам линии C57B1/6 (здоровым мышам и мышам с иммуносупрессией) Р-А антитела к ИФН-гамма (n=15) и дистиллированную воду (контроль, n=15) вводили внутрижелудочно в дозе 0,2 мл/мышь в течение 5 дней. Шесть мышей оставались интактными. На 5-е сутки после иммунизации общепринятыми методами [22, 23] определяли общее количество лейкоцитов в периферической крови (ОКЛ), весовые индексы (ИТ и ИС) и клеточность (ОКТ и ОКС) иммунокомпетентных органов (тимуса, селезенки), а также относительное (%) и абсолютное (х10 6 ) количество антителообразующих клеток (АО К) в селезенке мышей по методу A. Cunningham [24] и титр антител (АТ) в сыворотке крови с помощью стандартной реакции гемагглютинации (РГА).
Клеточный иммунный ответ изучали в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) на мышах-самках линии СВА (16—18 г) и мышах-самцах гибридах F1 (CBAxC57B1/6) (16—18 г). Р-А антитела к ИФН-гамма (n=9) и дистиллированную воду (контроль, n=9) вводили мышам внутрижелудочно в дозе 0,2 мл/мышь в течение 10 дней. В конце курсового введения Р-А антитела к ИФН-гамма или дистиллированной воды проводили сенсибилизацию мышей ЭБ 1х107/мышь (подкожно в объеме 0,1 мл), разрешающую дозу ЭБ (1х108 в объеме 20 мкл) вводили в подушечку задней лапы на 5-й день после сенсибилизации [22]. Параллельно в контралатеральную лапу вводили физиологический раствор в том же объеме. Интенсивность реакции оценивали через 24 ч по индексу реакции (ИР), который вычисляли индивидуально для каждого животного по формуле:
ИР (%) = (Ро-Рк)/Рк X 100,
где Ро — масса опытной лапы; Рк — масса контрольной лапы.
В отдельной серии экспериментов при постановке реакции ГЗТ у части опытных и контрольных животных (в каждой группе n=6, кроме контроля, где n=7) на 4-й и 5-й дни после инъекции сенсибилизирующей дозы ЭБ внутрибрюшинно вводили специфический ингибитор NO-синтазы — NMMA (NG-монометил-L-аргинин). Интенсивность реакции оценивали у каждого животного по индексу реакции.
Фагоцитарную активность Р-А антител к ИФН-гамма оценивали на мышах-самках линии СВА (n=48). Мышам- самкам линии СВА (16—18 г) внутрижелудочно в течение 10 дней вводили Р-А антитела к ИФН-гамма (n=24) и дистиллированную воду (контроль, n=24) в дозе 0,2 мл/мышь. Фагоцитарная активность нейтрофилов и макрофагов перитонеального экссудата оценивалась через 24 ч после окончания 10-дневного курса введения Р-А антител к ИФН-гамма или дистиллированной воды по способности этих клеток поглощать суточную культуру S. aureus, штамм 209; концентрация взвеси микробов — 100 млн/мл); учитывали процент нейтрофилов, либо макрофагов, поглотивших микробы (фагоцитарный индекс) и среднее число стафилококков, поглощенное одной клеткой (фагоцитарное число).
Пролиферативную активность Т- и В-лимфоцитов оценивали с помощью реакции бласт-трансформации [22], основанной на способности некоторых лектинов вызывать поликлональную активацию и пролиферацию лимфоцитов, которая оценивается радиометрически по интенсивности включения в клетки 3Н-тимидина. Для активации Т-лимфоцитов использовали фитогемагглютинин (ФГА); для активации В-лимфоцитов — митоген лаконоса (МЛ). В исследовании использовали взвесь мононуклеаров периферической крови 10-ти здоровых доноров. Пролиферативную активность оценивали с помощью реакции индуцированной (смешивая 50 мкл мононуклеаров, 50 мкл митогена и 50 мкл Р-А антител к ИФН-гамма) и спонтанной (смешивая 50 мкл мононуклеаров, 50 мкл Р-А антител к ИФН-гамма и 50 мкл ростовой среды) бласт-трансформации. В контроле вместо Р-А антител к ИФН-гамма добавляли 50 мкл ростовой среды (РС). Оценку результатов опыта определяли по индексу стимуляции (ИС):
ИС = О/К,
где О — радиоктивность в лунках с митогеном; К — радиоактивность в лунках без митогена.
Те же супернатанты культур мононуклеаров использовали и для оценки активности ИЛ-1 по методу Mizel S. B. [25]. Получали 4 вида супернатанта: 1) от клеток, стимулированных липополисахаридом (ЛПС, 75 мкг/мл) — для индукции продукции ИЛ-1 в присутствии препарата (50 мкл/мл); 2) от клеток, стимулированных ЛПС; 3) от клеток, культивируемых в присутствии препарата; 4) от клеток, культивируемых только в РС. Оценку результатов опыта определяли по индексу стимуляции (ИС), который рассчитывался по вышеприведенной формуле.
При оценке влияния Р-А антител к ИФН-гамма in vitro на функциональную активность естественных киллеров (ЕК) в качестве источника ЕК была также использована суспензия мононуклеарных клеток (МНК) периферической крови здоровых доноров. Функциональную активность ЕК определяли в цитотоксической реакции по их способности лизировать клетки миелобластоидной линии К-562, используя радиометрический метод. Р-А антитела к ИФН-гамма в виде водного раствора добавляли в полную ростовую среду из расчета 50 мкл на 1 мл среды.
Эксперименты по изучению влияния Р-А антител к ИФН-гамма на выработку ИФН-гамма, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10 проведены на мышах-самцах линии СВА/CaLac (18—20 г., 2—2,5 мес). Мышам-самцам линии СВА/CaLac ежедневно в течение 10 дней внутрижелудочно вводили Р-А антитела к ИФН-гамма (n=48) или дистиллированную воду (контроль, n=48) в дозе 0,2 мл/мышь. 6 мышей были интактными. Продукцию цитокинов определяли на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10 дни введения препаратов у 6 мышей в каждой точке. Лимфоциты выделяли из взвеси селезеночных клеток мышей на градиенте Фиколла-Пака (плотность 1,077), дважды отмывали средой 199 с 5% эмбриональной телячьей сывороткой. Жизнеспособные лимфоциты опытных и контрольных групп, а также фона доводили до концентрации 2х10 6 клеток/мл и инкубировали в течение суток без (спонтанный вариант) или с добавлением 20 мкг/мл ФГА (стимулированный вариант). ИФН-гамма в культуральных супернатантах тестировали иммуноферментным (ИФА) методом.
Результаты и обсуждение
В экспериментальных исследованиях in vivo Р-А антитела к ИФН-гамма стимулировали гуморальный иммунный ответ. Курсовое введение препарата в течение 5 дней мышам способствовало повышению эффективности гуморального иммунного ответа на корпускулярный тимусзависимый антиген (эритроциты барана) (иммунизация минимальными дозами антигена одновременно с первым введением препарата), при этом отмечалось повышение функциональной активности антителообразующих клеток в селезенке в 1,5 раза (pКурсовое введение Р-А антител к ИФН-гамма мышам в течение 10 дней повышало активность Т-эффекторов, что выражалось в усилении реакции гиперчувствительности замедленного типа, в ответ на сенсибилизацию эритроцитами барана: индекс реакции увеличился в 1,7 раза по сравнению с контрольной группой (pПри изучении фагоцитарной активности нейтрофилов и макрофагов перитонеального экссудата мышей, которую оценивали через 24 часа после 10-дневного курса введения препарата, была выявлена способность Р-А антител к ИФН-гамма стимулировать фагоцитоз за счет увеличения доли нейтрофилов и макрофагов, способных поглощать стафилококки на 37,4 и 62% по сравнению с контрольной группой, соответственно (pIn vitro Р-А антитела к ИФН-гамма при добавлении в культуру мононуклеаров оказывали умеренное комитогенное действие в реакции бласттрансформации, стимулируя пролиферацию как Т-, так и В- лимфоцитов. Добавление Р-А антител к ИФН-гамма к культуре мононуклеаров совместно с Т или В митогеном способствовало повышению индекса стимуляции в 1,7 и 1,6 раза, соответственно (p>0,05). При этом Р-А антитела к ИФН-гамма не оказывали влияния на спонтанную бласттрансформацию лимфоцитов [14].
В культуре мононуклеаров Р-А антитела к ИФН-гамма в 1,8 раза повышали выработку лимфоцитами ИЛ-1 (со стимуляцией ЛПС) и в 1,7 раза (без стимуляции ЛПС) по сравнению с контролем (p>0,05), а также увеличивали функциональную активность естественных киллеров, которые играют важную роль в защите организма от различных внутриклеточных микроорганизмов и опухолевых клеток, на 12,7% по сравнению с контролем (pПри изучении влияния Р-А антител к ИФН- гамма на продукцию ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10 было показано, что препарат стимулировал преимущественно функциональную способность Т-хелперов I типа, функциональными маркерами которых являются ИФН-гамма и ИЛ-2. При стимуляции лимфоцитов фитогемагглютинином на фоне введения исследуемого препарата происходило усиление продукции как ИФН-гамма и ИЛ-2, так и ИЛ-4 и ИЛ-10, что также говорит и о стимуляции Т-хелперов II типа [14]. На фоне курсового введения Р-А антитела к ИФН-гамма достоверно повышали спонтанную продукцию лимфоцитами ИФН-гамма относительно контроля на 1-е и 3-7-е сут наблюдения, с максимумом на 3-и сут введения — более чем в 8 раз по сравнению с исходным уровнем и в 6,5 раз по сравнению с контролем (pНа фоне введения P-А антител к ИФН-гамма повышение спонтанной выработки ИЛ-2 лимфоцитами селезенки мышей отмечали со 2-х по 7-е сутки. Однако статистически значимое увеличение в 1,5 раза в продукции исследуемого цитокина наблюдалось лишь на 3-е и 7-е сутки опыта (pПовышение спонтанной выработки ИЛ-4 лимфоцитами в 3 раза и в 1,4 раза относительно контрольной группы было зарегистрировано на 7-е и 10-е сутки, соответственно (pКурсовое введение P-А антител к ИФН-гамма не влияло на спонтанную выработку ИЛ-10 лимфоцитами селезенки, но достоверно повышало его ФГА-стимулированную продукцию на 40,6—84,5% по сравнению с контрольной группой на 1-5-е сутки эксперимента (pНеобходимо отметить, что возрастание продукции того или иного цитокина в спонтанном тесте, вероятно говорит о функциональном состоянии клеток продуцентов, в то время как в стимулированном варианте обусловливается преимущественно резервными возможностями лимфоцитов экспериментальных животных секретировать исследуемые клеточные факторы.
В клинических исследованиях была подтверждена способность препаратов на основе P-А антител к ИФН-гамма стимулировать синтез функционально активных ИФН-гамма и ИФН-альфа, а также активировать функции и повышать функциональный резерв Т хелперов и других иммунокомпетентных клеток (В-лимфоцитов, цитотоксических Т-лимфоцитов, ЕК-клеток, фагоцитов и др.) [28—30].
Проведенные исследования позволяют предположить следующий механизм иммунотропного действия P-А антител к ИФН-гамма (см. рисунок).
Выводы
В серии экспериментальных исследований иммунотропного действия было выявлено, что P-А антитела к ИФН-гамма (препараты анаферон и анаферон детский) in vivo стимулируют гуморальный иммунный ответ, в том числе на фоне иммуносупрессии: повышают функциональную активность антителообразующих клеток в селезенке; активизируют функцию Т-эффекторов, что выражается в усилении реакции гиперчувствительности замедленного типа; повышают фагоцитарную активность нейтрофилов и макрофагов перитонеального экссудата за счет увеличения процента активных фагоцитов. In vitro культуре мононуклеарных клеток P-А антитела к ИФН-гамма стимулируют пролиферативную активность Т- и В-лимфоцитов; повышают функциональную активность естественных киллеров; стимулируют выработку ИЛ-1 (в присутствии липополисахарида). Ex vivo было обнаружено стимулирующее действие P-А антител к ИФН-гамма на продукцию ИФН-гамма и функционально сопряженных цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10).
Ключевым механизмом иммунотропного действия P-А антител к ИФН-гамма является влияние на систему интерферонов и функционально сопряженных с ней цитокинов, приводящее к нормализации функциональной активности естественных факторов иммунной защиты (клеточный, гуморальный иммунный ответ, фагоцитарная активность нейтрофилов и макрофагов).
Фармакологической мишенью P-А антител к ИФН-гамма является ИФН-гамма и его рецептор, а точкой приложения иммунотропной активности P-А антител к ИФН-гамма — клетки иммунной системы, чувствительные к действию эндогенного ИФН-гамма. P-А антитела к ИФН- гамма способны стимулировать продукцию не только самого ИФН-гамма, но и ряда функционально сопряженных с ним цитокинов: вырабатываемых макрофагами (ИЛ-1), Т-хелперами I типа (ИЛ-2) и Т-хелперами II типа (ИЛ-4, ИЛ-10) [13, 26]. Это объясняет способность P-А антител к ИФН-гамма стимулировать клеточный и гуморальный иммунный ответ, а также увеличивать фагоцитарную активность нейтрофилов и макрофагов перитонеального экссудата [13, 25].
Полученные данные позволяют сделать вывод, что применение препаратов на основе P-А антител к ИФН-гамма (препараты анаферон и анаферон детский) эффективно для лечения и профилактики развития инфекционных заболеваний, а также для коррекции дисбаланса иммунной системы у иммунокомпрометированных пациентов (в том числе у пациентов в период реконвалесценции после инфекционных заболеваний).