три кофта для каких мутаций
От чего страдают сверхлюди: обратная сторона полезных мутаций
Мутации — двигатель эволюции живых организмов
Слово «мутация» в обычной жизни окрашено, как правило, не в самые радужные цвета. На ум приходят патологии, заболевания и другие неприятные изменения организма. Однако мутации — это не добро или зло, но стандартный механизм природы. В живом организме такие изменения происходят постоянно. Клетки делятся все время и иногда делают это с ошибкой. Большинство неточностей тут же находит такой механизм организма, как репарация, и моментально исправляет.
Геном — это совокупность всех хромосом. Каждая хромосома состоит из ДНК и белков. Гены образованы из группы последовательных нуклеотидов и расположены по всей молекуле ДНК.
Но иногда, по разным причинам, например, когда ошибок очень много, репарация оказывается бессильна, и «неправильные» клетки продолжают развиваться с поломкой. Значительная часть мутаций обычно «вымывается» из популяции, как невыгодная: это делает естественный отбор, к тому же около 20% людей по разным причинам не оставляют потомства. Однако некоторые мутации закрепляются, в одних случаях они приводят к врожденным болезням, в других — могут вывести человечество на новый этап развития.
«Если мутация дает какое-то явное преимущество, — увеличивает приспособленность, вероятность выжить, повышает плодовитость, делает организм более адаптированным, то обычно этот вариант вытесняет все остальные. Очень быстро, в течение нескольких поколений, он фиксируется в популяции, что поддерживается естественным отбором. Вместо изменчивости, или иначе — полиморфизма генов, мы наблюдаем один вариант», — объясняет Константин Крутовский, профессор Гёттингенского университета (Германия), ведущий научный сотрудник Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН, профессор кафедры геномики и биоинформатики Сибирского федерального университета.
Так случилось с нашими предками. Ученые Калифорнийского университета (Сан-Диего, США) обнаружили, что 2–3 млн лет назад у гоминид, древних предков современных людей, случилась мутация гена CMAH, благодаря которой у них появилось больше мышц, потовых желез, а также возросла выносливость. Эти новые особенности обеспечили первым людям доминирование над другими обитателями планеты: теперь они могли быстро бегать, причем на дальние расстояния, и охотиться днем в жару, когда другие хищники прятались в тени.
50 тыс. лет назад мигрировать из Африки на территорию современной Европы людям помогла мутация в гене ACTN3, кодирующем белок α-актинин-3. Благодаря ей предки европейцев смогли справиться с прохладным климатом, тело научилось обогревать само себя. Этот генотип редко встречается у этнических групп, живущих в жарких регионах: его имеет всего 1% кенийцев и нигерийцев.
Какие бывают мутации
Все мутации возникают спонтанно. От тех из них, что случаются без внешних воздействий, не застрахован абсолютно никто — даже самый здоровый человек, живущий в идеальном климате и питающийся правильной едой.
В другом случае клетка может мутировать под влиянием внешних факторов:
Все эти изменения происходят в теле конкретного организма и касаются только его. Другое дело, когда мутации затрагивают половые клетки. Будущее потомство может унаследовать измененные гены, которые «поломались» у родителей.
Мутировавшие гены могут нести нейтральные, вредные и полезные последствия. Последних — меньше всего. Когда случается мутация, шансов, что она что-то улучшит, а не наоборот, — очень мало. Но бывают и счастливые исключения. В гене происходят изменения, которые дают человеку новую способность, помогающую лучше приспособиться или даже выжить в конкретной среде.
Полезные мутации — дар или наказание?
87% тибетцев имеют мутацию в гене EPAS1, позволяющую им комфортно дышать разреженным горным воздухом: высота Тибетского плато составляет 4 тыс. м над уровнем моря, и здесь на 40% меньше кислорода, чем на равнине.
Житель низины не смог бы так жить, у него развилась бы высотная болезнь: головные боли, быстрая утомляемость, детская смертность была бы гораздо выше, чем у жителей гор. У тибетцев нет ни одной из этих проблем. Однако часто такие особенности имеют изнанку.
В 1994 году стала известна история о людях со сверхпрочным скелетом: в Коннектикуте (США) из страшной автокатастрофы водитель вышел без единого перелома. Рентгеновские снимки показали аномально плотные кости. Мужчину отправили в Йельский костный центр где обнаружилось, что его кости плотнее скелета обычного человека такого же возраста в восемь раз.
Позже выяснилось, что никто из его родных никогда ничего себе не ломал и не жаловался на ушибы. Исследования ДНК выявили мутацию в гене LRP5, сделавшую этих людей невероятно устойчивыми к различным повреждениям и ударам. Однако мужчина пожаловался, что ему никогда не удавалось держаться на воде, он всегда считал себя слишком тяжелым для плавания.
«С одной стороны, такие плотные кости менее ломкие, и человеку комфортно жить, осознавая, что риск получить переломы и травмы минимален. С другой стороны, такая плотность костей означает, что человек с большей вероятностью может утонуть, он менее плавучий, в отличие от того, у кого кости более полые», — объясняет Оксана Максименко, руководитель Центра высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины ИБГ РАН.
Носители мутации G6PD-Mahidol487A, затрагивающей ген фермента G6PD, практически невосприимчивы к малярии. Изменение в структуре серповидноклеточного белка гемоглобина делает эритроцит устойчивым к малярийному плазмодию, передаваемому через укусы комаров.
Естественный отбор позаботился о том, чтобы особенность прижилась в Азии и Африке, страдающих от малярии. Это очень опасный для жизни недуг: в 2019 году от него скончались 274 тыс. детей в возрасте до 5 лет (67% от всех «малярийных» смертей в мире).
Однако, например, от 18% до 25% населения юго-восточной Азии эта болезнь не страшна. Ученые из Института Пастера (Франция) и Университета Махидол (Таиланд) провели крупномасштабное эволюционное и эпидемиологическое исследование и доказали, что мутация позволяет своим обладателям не заболеть от укуса заразного комара, ответственного за половину всех случаев малярии в регионе.
Побочным эффектом мутаций могут стать заболевания крови, например, серповидноклеточная анемия, которая несет целый ряд необратимых последствий: от детских ишемических инсультов, повреждения селезенки у взрослых, легочной гипертензии, почечной недостаточности до летальных исходов.
Мутация в генах SCN9A, SCN11A и PRDM12 куда более редка: известно о полутора сотнях носителей на всей планете. Ее обладатели совсем не чувствуют боли, как Эшлин Блокер из американского городка Паттерсон. Повреждения в генах влияют на нервы, несущие болевые сигналы в мозг.
Эшлин окунала руки в кипяток, сдирала кожу с ладоней под струей отцовской мойки высокого давления, два дня ходила со сломанной лодыжкой, была укушена сотней огненных муравьев и получила много других травм. Никакой боли при этом она не ощущала, зато на теле каждый раз оставались отметины и шрамы.
Люди с такой мутацией редко доживают до 20 лет. Они могут погибнуть даже от аппендицита, потому что у них ничего не болит и проблему они замечают слишком поздно, когда уже началось смертельное воспаление. Эшлин Блокер сейчас 22 года, не так давно она попала в серьезное ДТП, отделавшись испугом.
«Спутник V»: О чем молчат Роспотребнадзор и Минздрав
Сколько «побочек» у российской противовирусной вакцины, и как это связано с нано-частицами
Никто уже не скрывает, что программа вакцинации населения страны от «короны» провалена. Мне на эту тему приходится говорить и с медиками, и с гражданами, которых власти рассматривают в качестве объектов вакцинации. Честные и профессиональные медики пожимают плечами и говорят, что наш основной препарат «Спутник V» — «кот в мешке».
Главной причиной для такого заявления является то, что российские власти в лице Минздрава, Роспотребнадзора, оперативного штаба по борьбе с коронавирусом настаивают на том, что, мол, «Спутник V» и другие российские препараты являются абсолютно безопасными. Никаких негативов. Это полный абсурд, что понятно даже человеку, очень далекому от медицины. В учебниках по фармакологии, вирусологии, эпидемиологии и другим медицинским дисциплинам написано черным по белому: абсолютно безопасных вакцин нет и быть не может.
Первая проблема заключается в том, что препараты, используемые сегодня в России для вакцинации, являются экспериментальными. Так, третья фаза клинических испытаний по «Спутнику V» должны завершиться только в конце следующего года. Человек может уколоться таким препаратом только добровольно, в порядке «эксперимента». Причем в случае возникновения «побочек» он, как это вытекает из российских законов, вправе требовать компенсаций нанесенного здоровью вреда.
Власти об экспериментальном характере препаратов предпочитают помалкивать. И даже добиваются того, чтобы принудительно заставить людей прививаться. Хотя это можно расценивать как нарушение Конституции и многих законов Российской Федерации!
Вторая проблема. Даже если препарат прошел все клинические испытания, получил официальный статус вакцины, по уму, совести и исходя из национальных интересов, следует осуществлять дальнейшее так называемое «администрирование вакцин». Т.е. фиксацию всех случаев побочных явлений после укола, сбор и консолидацию этой информации в единой базе данных, ее анализ. Для того, чтобы при необходимости вносить коррективы в сам препарат и в процесс вакцинации. И, если потребуется, даже прекращать вакцинацию.
Такое администрирование вакцин имеется в США. Там еще в 1990 году была создана Система учета негативных последствий вакцинаций. Чаще в СМИ фигурирует аббревиатура англоязычного названия: VAERS (Vaccine Adverse Event Reporting System). Она находится в ведении Центров по контролю и профилактике заболеваний (the Centers for Disease Control and Prevention — CDC) и Администрации по контролю за качеством продуктов питания и лекарств (the U.S. Food and Drug Administration — FDA).
На протяжении трех десятилетий она отслеживала «негативы» от использования десятков различных вакцин, которые применялись для защиты граждан Америки от самых разных инфекций и болезней. Медицинские учреждения должны направлять информацию о «побочках» в обязательном порядке, при желании ее могут представлять также пациенты и их родственники.
Похожая система есть в Европейском союзе. Она называется EudraVigilance (EV). В ЕС, согласно данным EV, по состоянию на 9 октября было зафиксировано 27.247 смертей и 2.563.768 «побочек» (в том числе тяжелых — 1.222.818). Мне известны также подобные системы в Великобритании и Австралии. В первой из названных стран число умерших составило 1.715 (по состоянию на 13 октября). Во второй — 524 (на 11 сентября).
В России же никаких признаков администрирования «Спутника V» и других вакцин от ковида нет. По крайней мере, в открытом доступе информация о летальных исходах и «побочках» отсутствует. В начале сентября я проделал эксперимент. Воспользовался телефонами «горячих линий» Минздрава, оперативного штаба правительства по борьбе с коронавирусом, Роспотребнадзора.
Вопрос у меня был простой: где я могу найти статистику по побочным последствиям применения вакцин от ковида в России? Минздрав и оперативный штаб мне честно ответили, что такой информацией не располагают. Посоветовали обратиться в Роспотребнадзор. Живого общения с последним у меня не получилось. Робот мне предложил в письменном виде сформулировать запрос и отправить по названному электронному адресу. Обещая ответить в течение нескольких минут также по почте. Скоро уже будет два месяца с момента того запроса, но ответа я так и не получил. Выяснилось, что подобное любопытство проявляли и некоторые мои знакомые журналисты, но результат был тот же. Так что Роспотребнадзор можно без натяжки назвать «черным ящиком». А «черным ящикам» люди доверять не могут.
Третья проблема. Она до последнего времени находилась несколько на периферии внимания критиков нынешней кампании вакцинации от короны в России. Но сейчас вышла на первый план.
По причине резонансного заявления главы Центра имени Гамалеи академика Александра Гинцбурга, которое он сделал 25 октября. Прошу прощения, но в тысячный раз повторю «новость», озвученную академиком: примерно 80% из тех, кто тяжело переболел ковидом с сертификатами об иммунизации «Спутником V», — владельцы липовых свидетельств. Гинцбург призвал провести тотальную проверку владельцев сертификатов. И сделать это предлагает с помощью специального анализа на наличие маркеров препарата: «Мы видим, что у людей отсутствуют эти маркеры в 80% случаев».
И до этого медики и просто сознательные граждане сомневались в том, что власти раскрыли полностью вакцинные «карты», т.е. состав «Спутника V» (равно как и других прививочных препаратов). Особенно люди волновались по поводу того, нет ли в отечественной вакцине каких-то компонентов, которые позволят с помощью специальных технических средств идентифицировать человека. Не станет ли вакцинация еще одним важным шагом в деле построения электронного концлагеря?
Сегодня такими компонентами могут быть нано-частицы, разработкой которых на Западе стали заниматься уже давно. Билл Гейтс как «филантроп» разработки вакцин особо и не скрывал, что такие нано-частицы очень нужны. Их можно вводить в тело человека специально. А можно вводить, как говорится, «в одном флаконе», вместе с вакцинным препаратом. Мол, они важны для того, чтобы привязать человека к электронному «паспорту здоровья». А «паспорт» поможет людям на всей планете сохранить здоровье и жизнь.
Для справки скажу, что в мРНК-вакцинах (вакцинах, созданных на основе матричных рибонуклеиновых кислот) есть нано-частицы. Самые известные — Pfizer, Moderna, которыми сегодня обкололи полмира. Власти США (где сосредоточена основная часть производства указанных препаратов) особо, конечно, не афишируют эту особенность вакцин Pfizer и Moderna.
Как отмечает Жанна Шмидт, патологоанатом из Марбургского университета, «в мРНК-вакцинах есть нано-частицы, и это никогда не скрывалось. Они используются для доставки нестабильной мРНК в клетки, действительно накапливаются и откладываются в адипоцитах (жировых клетках — В.К.) и лимфоузлах. У определенных категорий людей это может быть причиной лимфаденита, а при введении вакцины возможен анафилактический шок. Это все есть в информированном согласии, то есть, подписывая этот документ, человек понимает, что такое возможно, и для него это не является каким-то сюрпризом. Сейчас действительно такие случаи в Европе встречаются. Наши патологи об этом пишут. Кто вскрывает трупы регулярно, тот знает».
Правда, почему-то нано-частицы многих на Западе волнуют лишь с точки зрения возможных медицинских осложнений. А вот нашего брата еще больше волнует вопрос о том, что такие частицы становятся «крючком», на который Старший Брат ловит человека и не отпускает до конца жизни.
В России власти не вносят никакой ясности в вопрос по поводу наличия или отсутствия наночастиц (либо каких-то других маркеров) в отечественных препаратах (для справки: наш «Спутник» — вакцина иного рода, чем Pfizer, Moderna; она называется «векторной») Чем еще больше провоцируют недоверие к вакцинам со стороны народа. История вокруг «Спутника» в связи с заявлением академика Гинцбурга все больше обрастает разными слухами и пикантными деталями.
Вот, в частности, любопытное наблюдение военного эксперта, экс-члена комиссии ООН по биологическому и химическому оружию Игоря Никулина, которое, кстати, он озвучил еще за неделю до резонансного заявления Гинцбурга.
Эксперт делится воспоминанием совсем недавнего прошлого: «Зам НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Гамалеи Логунов, который отвечал за разработку вакцины „Спутник V“, в частных беседах со специалистами подтвердил, что в состав вакцины входят наночастицы. Это говорит о том, что, скорее всего, эта вакцина не наш оригинальный продукт, а часть глобального проекта по цифровизации человеческой популяции. Именно поэтому вакцину, не прошедшую стадию доклинических исследований, не зарегистрировала ВОЗ, но зарегистрировали более 60 стран. Видеть в этом что-то положительное я не могу».
А вот комментарий на заявление академика, которое сделал наш известный клинический фармаколог и патологоанатом Александр Эдигер: «Гинцбург говорит о маркерах. Хотелось бы узнать, о чем речь? Что это за маркеры, при помощи которых можно определить, была вакцинация „Спутником V“ или нет. Хотелось бы услышать данные, какому количеству людей были проведены исследования на наличие этих маркеров».
Выше я уже ссылался на немецкого медика Жанну Шмидт. Ее спросили, что она думает о заявлении академика Гинцбурга. Вот часть ее ответа: «Никакие компоненты вакцины не должны надолго накапливаться в тканях. Если имеются в виду адъюванты, то есть вещества, усиливающие иммунный ответ, то их накопление может рассматриваться как угроза жизни и здоровью и как длительный побочный эффект от вакцинации. Да, следы адъювантов действительно можно определить в крови у достаточно небольшого числа людей».
Т.е., по ее мнению, в качестве маркеров могут выступать какие-то специальные добавки типа нано-частиц. Оказывается, на Западе считали отсутствие таких добавок конкурентным преимуществом «Спутника» по сравнению с Pfizer, Moderna. Гинцбург фактически дал понять, что такого преимущества у «Спутника» нет.
Вот любопытная часть ответа Жанны Смит: «Еще один момент: как рассказывал Путин в том числе из-за сомнений в безопасности западных препаратов, в Россию сейчас массово ездят прививаться иностранцы. Если это так, то не подорвет ли их доверие к российской вакцине известие о том, что она содержит маркеры, не заявленные в ее составе?»
То, что заявление Гинцбурга подорвет (уже подорвало) доверие иностранцев к «Спутнику», еще можно пережить. Но и доверие россиян к «Спутнику» может быть обвалено.
Муковисцидоз — первые надежды
Муковисцидоз — первые надежды
CFTR — хлорный канал, мутации в котором являются причиной муковисцидоза. TMD — трансмембранный домен.
Автор
Редакторы
Статья на конкурс «био/мол/текст»: Муковисцидоз — самое распространенное из моногенетических заболеваний (обусловленных поломкой одного гена). При нем нарушено функционирование белка-переносчика ионов хлора через мембрану клетки — хлорного канала CFTR. Так как этот канал отвечает за нормальную работу эпителия в легких, кишечнике, поджелудочной железе и других органах, его дисфункция приводит к накоплению в этих органах слизи, повышению вероятности инфекций и в конце концов к преждевременной смерти. До последнего времени врачи могли лечить только симптомы муковисцидоза: разжижать слизь, расширять бронхи, снижать воспаление, а также уничтожать бактерий антибиотиками, причем все эти меры почти не продлевали жизнь. Но за последние годы был достигнут невиданный прогресс: средняя продолжительность жизни больных возросла более чем в два раза. В этой статье будет рассказано о препаратах, благодаря которым стал возможен такой успех, об истории их создания и перспективах. На данных примерах читатель также узнает, как происходит современная разработка лекарств.
Конкурс «био/мол/текст»-2018
Эта работа опубликована в номинации «Биофармацевтика» конкурса «био/мол/текст»-2018.
Генеральный спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.
Спонсором приза зрительских симпатий выступил медико-генетический центр Genotek.
Описание заболевания
Вначале рассмотрим подробнее, что за болезнь муковисцидоз и почему разработка лекарств против него оказалась таким непростым делом.
Большинство случаев этого страшного заболевания диагностируют в первые годы жизни, потому что муковисцидоз поражает все органы, но особенно — легкие и кишечник. Больные страдают от многочисленных нарушений работы почти всех систем организма: дыхательной, пищеварительной, опорно-двигательной, нервной, сердечно-сосудистой и других. Средняя продолжительность жизни больных составляет 30–40 лет (и сильно зависит от качества ухода), 90% пациентов умирает от легочных осложнений.
Муковисцидоз (или кистозный фиброз, как он называется по-английски) возникает у тех людей, у которых плохо работает или отсутствует белок CFTR. Его название расшифровывается как cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, то есть регулятор трансмембранной проводимости при муковисцидозе. Сейчас разберемся, какова роль CFTR в норме и почему его недостаток приводит к таким тяжелым последствиям.
Знай врага своего
Муковисцидоз — самое распространенное заболевание, вызванное одной генетической причиной. Ежегодно в России рождается около 650 человек с муковисцидозом [2], а в мире — один на 2000–5000 новорожденных страдает этой болезнью. В России на 2016 год таких больных было зарегистрировано около 3000, а во всем мире порядка 100 000 [3].
То есть он пронизывает мембрану клетки насквозь.
АТФ — аденозинтрифосфорная кислота, основная молекула, которая запасает и передает химическую энергию в клетках.
Рисунок 1. Диаграмма предполагаемой структуры белка CFTR в закрытом (слева) и открытом (справа) положениях. Два трансмембранных домена образуют канал. Открытие канала контролируется двумя внутриклеточными доменами (NBD1 и NBD2), которые способны связывать и гидролизовать АТФ (голубой). Регуляторный домен (зеленый) содержит сайты фосфорилирования (Р). Активация канала требует наличия остатка фосфорной кислоты на регуляторном домене. NBD1 и NBD2 связывают и гидролизуют АТФ, вызывая открытие канала путем взаимодействия с трансмембранными доменами. Одна из молекул АТФ остается связанной с NBD1 в течение нескольких минут. За это время происходит несколько циклов открывания-закрывания канала, обусловленных связыванием и гидролизом второй молекулы АТФ [4], [5].
Наличие ионов вблизи поверхности клеток необходимо для поддержания нормального осмотического давления, а это важно для циркуляции жидкости в околоклеточном пространстве. Поэтому постоянный контролируемый поток ионов хлора через мембрану необходим для нормального функционирования эпителия легких, кишечника, протоков поджелудочной железы, яичников, потовых желез.
При муковисцидозе в первую очередь поражаются именно эти органы: в железах образуется густая слизь, которая забивает протоки и мешает нормальной работе органов. А вот почему в легких и кишечнике нарушается работа врожденной иммунной системы, возникает хроническое воспаление и инфекции — стало более-менее понятно совсем недавно. На нынешний момент картина примерно такая: снижение концентрации ионов хлора в околоклеточном пространстве вызывает активацию эпителиального натриевого канала ENaC, который начинает закачивать натрий в клетку. Уменьшение концентрации NaCl возле поверхности клетки вызывает снижение осмотической силы, а, следовательно, количества воды, поступающей к клетке. В случае легких это приводит к осушению воздушных путей и снижению очищающей активности ресничек и слизистой оболочки (рис. 2 во врезке).
Патогенез муковисцидоза
Поверхностный реснитчатый эпителий легких покрыт слоем геля, который называется ASL (airway surface liquid, легочный сурфактант). Он состоит из белков (преимущественно муцинов) и ДНК в солевом растворе. В норме, во время дыхания, его толщина составляет 25 мкм. У больных муковисцидозом толщина геля сокращается до 3 мкм, и реснички при этом не работают в полную силу (рис. 2). Однако в ответ на механический стресс многие клетки, в том числе эпителиальные, выделяют АТФ, ионные каналы (не только хлорный, но и натриевый и кальциевый) получают дополнительную стимуляцию, и ASL увеличивается до 7 мкм. Поэтому постукивание по грудной клетке является эффективным способом помощи от удушья при муковисцидозе [6].
Рисунок 2. Модель патогенеза муковисцидоза. В нормальных воздушных путях (слева) толщина слизистого слоя (ASL) обусловлена нормальной работой каналов CFTR и ENaC. MCC — мукоцилиарный клиренс, то есть скорость очистки воздушных путей с помощью движения слизи (в мкм/с). При муковисцидозе (справа) из-за дефектного CFTR снижение количества ионов хлора вызывает усиленную абсорбцию ионов натрия, что приводит к дегидратации поверхности, повышению вязкости слизи и компрессии ресничек. Неподвижная слизь может вызывать воспалительную реакцию сама по себе, а также является идеальной средой для размножения бактерий.
Постоянный ток слизи вдоль поверхности воздушных путей очень важен для функционирования защитной системы легких. При этом слизь должна быть достаточно жидкой, чтобы растекаться по поверхности эпителия после секреции, но и достаточно вязкой, чтобы движение ресничек эпителия вызывало ее направленный ток. У больных муковисцидозом слизь содержит слишком мало воды, поэтому она густая и неподвижная, от нее трудно избавиться даже при кашле. Собственно, русское название болезни и происходит от двух латинских слов: mucus («слизь») и viscosus («вязкий»).
Поскольку слизь — это полимерная сетка, образованная белками, она содержит поры. Характерная черта слизи при патологии — слишком мелкий размер пор. В нормальной слизи они имеют диаметр 0,2–1 мкм, а при болезни — менее 0,1 мкм. В результате нейтрофилы — клетки иммунной системы, которые в первую очередь отвечают за защиту от бактерий, — не могут проникнуть изнутри сквозь слой слизи. Бактерии на поверхности воздушных путей размножаются беспрепятственно и вызывают хронические инфекции, которые являются главной причиной смертности при муковисцидозе (80% пациентов) [7]. Более того, на уплотненной слизи, в отличие от обычной, бактерии образуют макроколонии, так называемые биопленки, которые особенно устойчивы к действию иммунной системы и антибиотиков [8].
Из сказанного понятно, что одним из средств улучшить состояние больных муковисцидозом должна быть регидратация легких, которую можно обеспечить с помощью ингаляции гипертонического раствора соли. Это паллиативная мера, не воздействующая на причину болезни, но, тем не менее, она позволяет снизить количество осложнений [6].
Не только легкие: что еще поражается при муковисцидозе
В нашей статье речь идет в основном о легких, потому что легочные проявления муковисцидоза наиболее заметны, однако в той или иной мере при болезни затрагиваются все органы, где в норме экспрессируется CFTR.
У 85–90% пациентов наблюдается экзокринная поджелудочная недостаточность, то есть дисфункция протоков поджелудочной железы, которые вырабатывают пищеварительные ферменты. Из-за этого таким больным с рождения требуется специальное питание через трубку, так как они не способны переваривать грудное молоко и обычные смеси.
У большинства больных возникают проблемы с фертильностью, так как с разной степенью тяжести поражаются протоки половых желез, эпителий половых органов.
Помимо этого, в зависимости от типа заболевания могут поражаться носоглотка, желудочно-кишечный тракт (возникает непроходимость кишечника), желчный пузырь (появление камней), сердце (увеличение) и другие органы.
До открытия молекулярных причин болезни пациентов лечили только симптоматически — разжижая слизь, применяя антибактериальные, противовоспалительные препараты и физиотерапию. У пациентов с нарушениями ЖКТ и поджелудочной железы эффективна терапия диетами и пищеварительными ферментами. Все эти меры облегчают состояние пациентов, однако настоящий скачок в продлении жизни и улучшении ее качества стал возможным только благодаря открытиям молекулярной биологии и рациональной разработке лекарств [9], [10].
Фокус на CFTR
Курсивом обозначается ген, а прямым шрифтом — соответствующий ему белок.
Мутации удобно разделить на несколько классов в соответствии с тем, какие последствия они вызывают (рис. 3) [12].
Рисунок 3. Классы мутаций CFTR при муковисцидозе. GA — аппарат Гольджи; ER — эндоплазматический ретикулум. Красный овал — ядро клетки.
Мутации I класса
Мутации I класса встречаются примерно у 10% пациентов. При них белок CFTR вообще не синтезируется или синтезируется в усеченном виде и сразу деградирует, потому что в гене произошла замена кодирующего аминокислоту кодона на стоп-кодон, или сдвиг рамки считывания, или появился сигнал неправильного сплайсинга. Самая частая мутация — замена глицина-542 на стоп-кодон.
Мутации II класса
Наиболее распространены мутации II класса, вызывающие неправильные сворачивание белка и последующий процессинг клеточными механизмами. Самая частая мутация — F508del (делеция фенилаланина в положении 508 ). 70% пациентов гомозиготны по этой мутации (то есть она присутствует в обеих копиях гена CFTR), а у 90% есть хотя бы один мутантный аллель [14]. У гомозиготных пациентов наблюдается тяжелое течение муковисцидоза, а гетерозиготы по CFTR-F508del, у которых одна из копий гена нормальна, не имеют симптомов болезни. Существует гипотеза, объясняющая стабильность такого тяжелого заболевания в человеческой популяции: у гетерозигот в меньшей степени происходит потеря воды при болезнях, сопровождающихся диареей, например, при холере и брюшном тифе. Соответственно, раньше, когда эти болезни были одной из основных причин смертности, особенно детской, шел отбор на дефектные копии гена [15].
F — обозначение фенилаланина, а del обозначает делецию, то есть отсутствие аминокислоты.
Мутация F508del приводит к тому, что белок неправильно сворачивается и еще в эндоплазматическом ретикулуме не проходит «контроль качества» со стороны клеточных систем и направляется на деградацию, не доходя до плазматической мембраны.
Подробности о мутации F508del
Рисунок 4. Расположение фенилаланина-508 (F508) в структуре CFTR
Фенилаланин-508 находится в домене NBD1 (рис. 4) в области контакта с трансмембранным доменом [16], [17]. Потеря фенилаланина в этом положении приводит к нестабильности контакта между доменами, и плохо свернувшийся белок распознается шаперонами эндоплазматического ретикулума — белками, которые обеспечивают дальнейшее присоединение убиквитиновой метки к дефектному белку. Помеченный убиквитином белок транспортируется в протеасому, где разрезается на части протеазами [18]. Кстати, эффективность транспорта нормального CFTR из эндоплазматического ретикулума к поверхности также сравнительно невелика и находится на уровне 60% [14].
Впрочем, 1% неправильно свернутого CFTR-F508del все же может достигнуть клеточной поверхности, но там он работает с очень низкой эффективностью из-за того, что мутация нарушает правильную подвижность доменов, необходимую для открывания и закрывания канала [19] (см. врезку). Кроме того, в течение 2,5 минут белок удаляется с поверхности в эндосомы, и там снова решается его судьба: он либо возвращается обратно в плазматическую мембрану клетки, либо уничтожается. Понятно, что большинство мутантных молекул будет при этом уничтожено.
Мутации III класса
Мутации III класса встречаются у 4–5% пациентов и приводят к неправильной регуляции открытия ионного канала. Из них наиболее обычная — G551D, то есть замена глицина в 551 положении домена NBD1 на аспарагиновую кислоту. Она приводит к тому, что канал остается преимущественно закрытым. Появление в этом положении остатка аспарагиновой кислоты с отрицательно заряженной боковой цепью —CH2–COO − препятствует связыванию АТФ и сближению доменов NBD1 и NBD2 из-за отталкивания отрицательных зарядов между аспартатом и фосфатными группами АТФ, а также кислотными остатками домена NBD2 [19].
Мутации IV и других классов
Некоторые исследователи различают также мутации классов V–VI, при которых производится работающий белок, но в недостаточных количествах, или происходит быстрое удаление CFTR с поверхности клеток. У таких пациентов течение болезни также сравнительно легкое [11].
Другие причины муковисцидоза
Мы разобрали тут мутации самого белка CFTR, однако понимание молекулярных причин патогенеза муковисцидоза осложняется тем, что CFTR взаимодействует с массой других белков в клетке. Мы уже упоминали выше шапероны, отвечающие за правильное сворачивание (фолдинг) CFTR, и транспортные белки, которые переносят его в плазматическую мембрану. В последние годы с помощью полногеномного секвенирования и поиска ассоциаций (genome-wide association studies, GWAS) [20] идентифицировали еще ряд партнеров по связыванию с CFTR, которые явно играют роль в конкретных проявлениях муковисцидоза. Это и белки, участвующие в иммунном ответе, и другие ионные каналы, и муцины — всего более сотни белков [21].
Почему для муковисцидоза — самого распространенного наследственного заболевания — первые препараты, направленные на молекулярную причину болезни, появились только недавно, в 2012 году? Причин несколько: во-первых, сломать проще, чем починить, поэтому среди лекарств гораздо больше ингибиторов, блокаторов, антагонистов, чем активаторов и агонистов. В случае CFTR требуется восстановить неработающую функцию, что гораздо сложнее. Во-вторых, при других наследственных заболеваниях, обусловленных дефектом одного гена (например, гемофилии или болезни Гоше), пациентам, как правило, помогает введение дефектного белка в виде инъекций. В случае муковисцидоза проблема так просто не решается. CFTR — мембранный белок, и если его просто ввести пациенту, он не попадет в мембрану эпителиальных клеток и не будет выполнять там нужные функции. Делаются попытки разработать генную терапию муковисцидоза, например, доставить ген CFTR в клетки с помощью вирусных частиц, но они пока не увенчались успехом.
А вот малые молекулы, которые были разработаны с учетом сведений о структуре и функции CFTR, уже произвели революцию в лечении муковисцидоза, и, надеемся, это только начало. О них мы и поговорим дальше.
«Калидеко»: первая ласточка
Сразу после открытия факта, что муковисцидоз вызван мутациями в гене CFTR, у исследователей возникло желание синтезировать вещества, которые могли бы хоть отчасти скомпенсировать эффект данных мутаций. Довольно быстро стало понятно, что эти вещества будут грубо делиться по своей функции на два типа — корректоры, которые будут повышать количество дефектного белка (например, с мутацией F508del) на поверхности клетки, и потенциаторы, которые будут усиливать активность белка, уже находящегося на поверхности. Наиболее простой мишенью при этом выглядят мутации класса III: при них белок правильно свернут, находится на мембране, но преимущественно в закрытом состоянии. Поэтому с 2000-х годов начали поиск таких соединений, которые бы повышали вероятность его пребывания в открытом состоянии [22].
Первые несколько классов соединений были либо недостаточно активны, либо малоселективны (то есть связывались и с другими белками), либо обладали неподходящими фармакологическими свойствами (плохая растворимость, стабильность, проникновение в ткани). Наконец в 2009 году, после многочисленных раундов поиска оптимальной структуры, была опубликована структура вещества VX-770 (рис. 5), позже получившего название ивакафтор (торговое наименование — «Калидеко», Kalydeco) [23]. Расскажем немного подробнее обо всём пути разработки этого соединения.
Рисунок 5. Химическая структура ивакафтора («Калидеко», VX-770) (а) и генистеина (б)
История разработки началась в 2000 году. В ту пору компания Aurora Biosciences, которая занималась разработкой систем скрининга для Большой фармы, решила инициировать свою собственную разработку и получила грант от Фонда муковисцидоза (Cystic Fibrosis Foundation). В 2001 году Aurora была куплена компанией Vertex Pharmaceuticals, и та продолжила исследования.
Скрининг — в данном случае процесс выбора нужной молекулы из большого множества.
Для начала потребовалось создать систему скрининга, которая бы подходила для отбора веществ, активных в отношении мутантов CFTR. Для первичного отбора использовали клеточную культуру мышиных фибробластов, синтезирующих мутантный CFTR-F508del. Для определения влияния исследуемой молекулы на хлорный канал ее добавляли к клеточной культуре, затем добавляли флуоресцентный маркер, чувствительный к изменениям мембранного потенциала из-за потока ионов хлора и «включали» CFTR, добавляя форсколин, активирующий канал.
Так было протестировано 228 000 соединений [24], многие из которых отдаленно напоминали генистеин — известный потенциатор CFTR, который, однако, не подходит для лекарственного применения из-за низкой активности и быстрой деградации в организме.
Путь «Калидеко»
Для дальнейшего тестирования брали те соединения, которые были на 65% сильнее генистеина. Так было отобрано 1535 молекул, из которых 278 подтвердили свою активность в повторном тесте. Из них было откинуто еще 145 соединений по причине наличия примесей и потенциальных сложностей синтеза. Оставшиеся 133 молекулы подвергли дополнительному отбору на других клеточных линиях и культурах эпителиальных клеток, в том числе синтезирующих мутант CFTR-G551D. Для лучшего соединения (оно называется «лид» — от англ. lead) был синтезирован ряд аналогов и подвергнут тестированию на способность потенцировать ряд мутантов CFTR, а также на селективность и благоприятные фармакокинетические свойства у животных.
Фармакокинетика — это превращения лекарства в организме, то есть его всасывание, распределение по тканям, метаболизм и выведение.
Время, за которое концентрация вещества, введенного в организм, падает в два раза.
Цитохромы P450 — белки печени, которые отвечают за метаболизм многих лекарств, причем у разных людей по-разному. Чем меньше лекарство на них влияет, тем меньше вероятность взаимодействия с другими лекарствами, потенциальная токсичность и вариабельность действия.
Затем VX-770 тщательно изучали in vitro (на изолированных клетках) и in vivo (на животных) [22]. Определили фармакокинетические параметры молекулы у мышей, крыс, собак и обезьян, показали пероральную биодоступность у крыс и собак на уровне 40–50% (то есть что почти половина проглоченного препарата попадает в кровь).
Исследования эффективности на животных моделях для ивакафтора не проводили, хотя, как правило, это необходимо для получения разрешения на клинические исследования. Но в данном случае подходящей модели не было, потому что ивакафтор не связывается с мышиным CFTR, а трансгенных мышей с человеческим белком не было на момент выхода препарата в клинические исследования.
Разработка препарата шла невероятно быстро: уже в 2008 году были опубликованы первые клинические данные для ивакафтора, а к моменту регистрации в 2012 году были доступны данные трех клинических исследований. На 2018 год в пяти двойных слепых клинических исследованиях [25], [26] уже приняли участие 342 пациента. Основным показателем, который изучается у больных муковисцидозом, является FEV1 — объем форсированного выдоха (forced expiratory volume) за одну секунду. Причем измеряется не абсолютный объем, а процент от нормы для данного пола, возраста, расы и роста. Другие важные показатели — безопасность препарата, частота легочных обострений (выражается в необходимости приема антибиотиков и госпитализации) и качество жизни (определяется по анкете, которую заполняет пациент).
Клинический случай
Вот как выглядит эффект ивакафтора у отдельного пациента: у мужчины 33 лет с муковисцидозом оказался генотип F508del/G551D. FEV1 за последние годы упал с 85% до 67% от нормального. Пациенту приходилось принимать 2–3 курса антибиотиков в год, он страдал поджелудочной недостаточностью, похудением, регулярными запорами и прогрессирующим поражением суставов. Через несколько дней после начала приема ивакафтора начали улучшаться все симптомы, мокроты стало меньше, и она стала лучше отходить. Через месяц функция легких улучшилась на 15% [27].
Рисунок 6. Ожидаемая продолжительность жизни без муковисцидоза, с муковисцидозом при применении ивакафтора и с муковисцидозом без ивакафтора
Ивакафтор у детей и взрослых с мутацией G551D через 24 недели приема по сравнению с плацебо улучшал FEV1 на 5–10% и снижал риск обострений на 55%. У взрослых (но не у детей) он также повышал качество жизни по сравнению с плацебо. Воздействие препарата на ионный канал подтверждалось снижением концентрации хлорида в потовой жидкости [27], [28]. Затем ивакафтор показал эффективность и при наличии других мутаций класса III [11]. Немаловажно, что препарат оказался очень безопасным — частота побочных эффектов не превосходила плацебо. К сожалению, в России он так до сих пор и не зарегистрирован.
Хотя пока недостаточно данных для того, чтобы говорить о снижении смертности от муковисцидоза под воздействием ивакафтора, но проведенное моделирование показывает, что его влияние на FEV1 способно вылиться в увеличение продолжительности жизни в среднем на 15 лет (рис. 6), а также снизить потребность в трансплантации легких [29].
Механизм действия «Калидеко»: пока гипотеза!
Точный молекулярный механизм действия ивакафтора пока так и не установлен. Только в 2018 году получили данные [32], говорящие о том, что он связывается с трансмембранным доменом CFTR и каким-то образом стабилизирует открытое состояние (рис. 7).
Рисунок 7. Предполагаемый механизм действия ивакафтора (VX-770). Ивакафтор (желтый) связывается с белком CFTR и стабилизирует его в открытом состоянии, позволяя ионам хлора выходить наружу.
Несмотря на то, что ивакафтор оказался настоящим прорывом в терапии муковисцидоза, его недостаток в том, что он помогает всего 4–5% больных — у пациентов с гомозиготной мутацией F508del он оказался неэффективен [34]. Такой факт мог бы показаться странным, если учесть, что ивакафтор был отобран по активности на клетках с CFTR-F508del. Однако не нужно забывать: эти клетки предварительно выдерживались при комнатной температуре, что помогает правильно свернуться даже мутантному белку, поэтому на их поверхности было достаточно CFTR-F508del.
Комбинации
Понятно, что для охвата большинства пациентов надо создавать молекулы, эффективные у пациентов с мутацией F508del (напомним, они называются корректорами). Компания Vertex взялась за разработку таких препаратов одновременно с потенциаторами. После скрининга 164 000 молекул и нескольких раундов оптимизации было синтезировано вещество VX-809, которое в клеточных тестах в семь раз улучшало созревание CFTR-F508del и в пять — его способность переносить ионы хлора [35]. Позже оно получило название люмакафтор (lumacaftor).
Люмакафтор пробовали применять в режиме монотерапии (без сочетания с другими препаратами), но он оказался малоэффективен. Поэтому Vertex провела клинические исследования комбинации люмакафтор/ивакафтор, которая получила название «Оркамби» (Orkambi), и зарегистрировала ее в 2015 году.
Оказалось, что добавление люмакафтора к ивакафтору несколько улучшало течение болезни у пациентов с гомозиготной мутацией F508del, хотя эффект был не таким сильным, как в случае применения ивакафтора у пациентов с CFTR-G551D. FEV1 улучшался примерно на 5% по сравнению с плацебо, примерно в полтора раза снижалось количество обострений, улучшалось качество жизни [31]. Комбинация оказалась не столь безопасной, как ивакафтор в одиночку: небольшая часть пациентов прекратила прием препарата из-за удушья. Тем не менее эта комбинация позволила охватить около 45% пациентов с муковисцидозом.
Однако параллельно обнаружили, что у пациентов с мутацией F508del ивакафтор вообще несколько снижает эффективность корректоров [36], и, следовательно, требуются новые препараты и комбинации, чтобы повысить эффективность терапии и охватить тех пациентов, кому не подходят существующие лекарства. Кроме того, оказалось, что люмакафтор активирует цитохром CYP3A — белок печени, который отвечает за метаболизм ивакафтора, что снижает эффективность последнего [37].
Компания Vertex не собирается останавливаться: в 2018 году она вывела на рынок новую комбинацию — тезакафтор + ивакафтор («Симдеко», Symdeco). Тезакафтор тоже был обнаружен в ходе высокопроизводительного скрининга 150 000 соединений в 2005 году [38]. В сочетании с ивакафтором на клетках эпителия бронхов, взятых у пациентов с гомозиготной мутацией CFTR-F508del, он продемонстрировал повышение транспорта хлорида до 15,7% от нормального. Также было показано, что комбинация увеличивает частоту биения ресничек эпителия [39].
В клинических исследованиях Symdeco оказался более эффективным, чем один ивакафтор, а главное — комбинация оказалась совсем безопасной: в группе препарата наблюдалось даже меньше нежелательных явлений, чем в плацебо-группе [31].
По структуре тезакафтор похож на люмакафтор, и в обоих случаях точно не известно, где именно они связываются с CFTR и каков механизм компенсации мутации F508del. Бесценные данные по трехмерной структуре CFTR были получены относительно молодым методом криоэлектронной микроскопии, за который в 2017 году присудили Нобелевскую премию по химии [40].
Механизмы связывания лекарств
Расчеты методом молекулярного докинга позволили предположить, что обе молекулы связываются вблизи С-конца первого трансмембранного домена, как раз в том месте, где он контактирует с доменом NBD1 (рис. 8). В непосредственной близости от сайта связывания находятся остатки F508 и некоторые другие, мутации которых отвечают за неправильное сворачивание CFTR (то есть мутации класса II). Исследователи даже делают предположение, каким образом те или иные части молекул-корректоров компенсируют соответствующие мутации [3]. В дальнейшем такие трехмерные данные, вероятно, позволят разрабатывать новые лекарства от муковисцидоза с улучшенными характеристиками.
Рисунок 8. Трехмерная модель связывания корректоров CFTR в предположительном сайте связывания. а — Зеленым цветом обозначен люмакафтор, сиреневым — тезакафтор. б — Взаимодействие остатка F508 с α-спиралью ICL4 домена NBD1. Находящиеся рядом остатки R1070 и V510 в случае замены их на более объемные могут скомпенсировать дефект сворачивания белка, но не исправляют дефект функции.
Перспективы
Vertex ведет исследования новых, тройных комбинаций, где к комплексу тезакафтора и ивакафтора будет добавляться еще один корректор — VX-659, или VX-445, или VX-152. Эти три молекулы были идентифицированы в ходе скрининга в присутствии тезакафтора. На клетках комбинация каждого из этих веществ увеличивала поток ионов хлора до 68–75% от нормы [42].
Результаты исследования фазы 3 для первой такой комбинации станут известны в конце 2018 года, для второй — в середине 2019. В фазе 2 увеличение FEV1 по сравнению с плацебо для тройной комбинации тезакафтор + ивакафтор + VX-659 составило 13%, что свидетельствует о довольно высокой эффективности комбинации [41].
На более ранней стадии есть у Vertex и совсем новые разработки — в фазе 2 исследуется комбинация потенциатора, корректора и ингибитора ENaC. Разработчики надеются, что, снижая отток ионов натрия с поверхности эпителиальных клеток внутрь, они добьются еще лучшего восстановления слизистого слоя.
Еще одна интересная разработка — дейтерированный ивакафтор, то есть такой, у которого некоторые атомы водорода заменены на более тяжелый изотоп дейтерий (рис. 9). Это не влияет на активность ивакафтора по отношению к CFTR, но делает его более устойчивым к превращениям в организме. В итоге его период полувыведения примерно в полтора раза длиннее, чем у ивакафтора, что позволяет дозировать его один раз в день вместо двух. Сейчас для дейтерированного ивакафтора идут исследования фазы 2 [43].
Рисунок 9. Дейтерирование молекулы увеличивает размер атома водорода и меняет характер ее взаимодействия с некоторыми веществами
На совсем ранней стадии у Vertex есть и генная терапия, использующая систему CRISPR-Cas9 [45], и мРНК, компенсирующая дефекты CFTR. Однако множество провалов в этой области пока не дают основания утверждать, что именно эти подходы сработают.
Заключение
К сожалению, пока в России не зарегистрировано ни одно из новых средств, описанных в данной статье, но, надеемся, ситуация в ближайшие годы изменится.
На примере муковисцидоза интересно проследить взаимовлияние между разными уровнями организации материи: изменение всего нескольких атомов в молекуле белка CFTR отражается на работе клетки, затем ткани, органа и всего организма. А последствием этого является организация социальных структур из сотен людей, которые предпринимают усилия для компенсации дефекта на уровне молекул.
Вылечить муковисцидоз пока невозможно — для этого требуются более совершенные средства генной терапии, чем у нас есть сейчас. Но описанные в этой статье препараты позволяют значительно улучшить жизнь большинства больных. Главная задача — разработка таких средств, которые бы помогали всем пациентам независимо от мутаций CFTR.