В чем заключается исследования выделенных органов в питательной среде
Классический бактериологический метод
Классический бактериологический метод
04 января 2017
Бактериологический (культуральный) метод исследования заключается в выявлении патогенных микроорганизмов и определении их чувствительности к антибиотикам. Процесс выявления микроорганизмов состоит из нескольких этапов:
Первый и второй этапы бактериологического исследования одинаковы и для классического, и для автоматического бактериологического методов.
Посев делают таким образом, чтобы получить отдельные изолированные колонии.
Просматривают посевы на питательных средах. По внешнему виду колоний (размер, цвет, форма), определёнными быстрыми тестами и микроскопией определяют возможный вид микроорганизмов и их значение в конкретном случае. Избранные колонии отсеивают на универсальные питательные среды для накопления чистой культуры микроорганизмов. В случае роста колоний только одного вида можно проводить идентификацию и определение чувствительности без этапа накопления чистой культуры.
В зависимости от вида микроорганизма проводят его идентификацию (определение биохимических и антигенных свойств) с помощью фиксированного набора субстратов и сывороток. Субстратами являются углеводы, аминокислоты и другие сложные соединения. По результатам устанавливают род и вид микроорганизма.
Для установления вида некоторых микроорганизмов может потребоваться серологическая идентификация.
Все среды для идентификации и определения чувствительности к антибиотикам готовятся и стерилизуются отдельно. Такая процедура очень трудоемкая, то есть требует много ручного труда и времени, дополнительного оборудования. Таким образом у данного метода низкий уровень стандартизации.
Для идентификации некоторых требовательных клинически значимых видов микроорганизмов необходимы сложные и дорогие субстраты, которые в рутинной практике трудно готовить и использовать. Из-за этого спектр микроорганизмов, которые можно было бы идентифицировать, сужается по сравнению с возможностями автоматического анализатора.
Определение чувствительности к антибиотикам проводится с учетом результатов идентификации и вида биологического материала.
При использовании классического бактериологического метода, определение чувствительности к антибиотикам происходит диско-диффузным методом. Этот метод базируется на изучении зон задержки роста микроорганизма вокруг бумажного диска, который пропитан антибиотиком. В зависимости от зон задержки роста определяют устойчивые, умеренно-стойкие и чувствительные штаммы микроорганизмов к тому или иному антибиотику. Данный метод является наиболее распространенным для изучения чувствительности, а также дешевым и простым в исполнении. Однако он также плохо поддается стандартизации, поскольку требует много ручного труда.
В настоящее время проведения микробиологических исследований является важной и актуальной деятельностью в биологии и медицине, так как они позволяют с высокой степенью точности и достоверности подтвердить или опровергнуть факт присутствия в организме человека возбудителей инфекционных заболеваний. Классический бактериологический метод исследования решает задачи выделения чистой культуры возбудителя с его последующей идентификацией. Благодаря микробиологическим методам исследования можно установить возбудителей тех или иных инфекционных заболеваний и подобрать рациональное лечение этого заболевания.
Преимущества автоматического метода
1. Скорость получения результата. Результат наших исследований является максимально быстрым. Уже на 3 сутки Вы получаете название микроорганизма, который был обнаружен в исследуемом образце, а также его чувствительность к антибиотикам. (!) Срок исследований в автоматическом методе продлен до 5 суток за счет длительного роста грибов рода Candida.
2. Точность. Автоматический анализатор дает возможность быстро и очень точно определить какой именно из 400 микроорганизмов есть в биоматериале.
3. Большой спектр антибиотиков к которым определяется чувствительность позволяет врачу назначить наиболее рациональную антибиотикотерапию с учетом характера заболевания и особенностей пациента. К тому же определение чувствительности таким методом является максимально быстрым и точным по сравнению с классическим.
Важно! В результате микробиологического исследования проведенного автоматическим методом антибиотикочувствительность издается с показателем МИК * (минимальная ингибирующая концентрация)
В чем заключается исследования выделенных органов в питательной среде
О компании
Бактериологические исследования
Бактериологическое исследование — предназначенное для выделения бактерий и изучения их свойств с целью постановки микробиологического диагноза.
Исследуемый материал следует брать в асептических условиях в стерильную посуду и доставлять в лабораторию как можно скорее. В случае необходимости пробы следует хранить на холоде. Методика взятия проб зависит от объекта, характера заболевания и свойств микроорганизма. Одним из распространенных приемов бактериологического исследования является бактериоскопия.
Для изучения нефиксированных бактерий пользуются двумя методами: раздавленной (между предметным и покровным стеклами) капли и висячей капли. Следует помнить, что препараты нефиксированных бактерий заразны.
К числу важнейших элементов бактериологического исследования относятся посевы и пересевы бактериальных культур, производимые бактериальной петлей или пастеровской пипеткой. Петлю стерилизуют прокаливанием в пламени, затем ее остужают прикосновением к участку незасеянного агара или ополаскивая в стерильной жидкости. При использовании пастеровской пипетки ее кончик обламывают пинцетом, несколько раз проносят пипетку через пламя горелки и дают остыть. При посевах используют жидкие и твердые питательные среды. При посеве на скошенный агар культуру бактерий растирают петлей по поверхности агара. При посеве в толщу агарового или желатинового столбика питательную среду прокалывают до дна пробирки петлей или особой иглой. При посеве в жидкую среду надо следить, чтобы жидкость не выливалась и не смачивала края пробирок и пробки. Посевы и пересевы следует проводить вблизи пламени газовой горелки, пробирки не должны долго оставаться открытыми, петля или пастеровская пипетка с культурой не должна ни к чему прикасаться; перед тем как закрывать пробирку, края ее следует прожечь. Засеянные пробирки необходимо тотчас же надписать.
Методы бактериологического исследования все шире внедряются в практику для более детального обследования больных, установления этиологического фактора воспалительного процесса, назначения рациональной терапии и определения ее эффективности.
Разнообразие клинического материала и своеобразие микрофлоры отдельных органов определяют особенности методов бактериологического исследования, которые требуют применения специальных приемов отбора проб, посевов на питательные среды и проведения хода анализов.
Бактериологическое исследование клинического материала состоит из нескольких этапов:
— отбор проб на исследование;
— посев на питательные среды;
— выделение чистой культуры;
— идентификация и дифференциация выделенных культур микроорганизмов;
— анализ результатов исследования.
Методы бактериологического исследования все шире внедряются в практику для более детального обследования больных, установления этиологического фактора воспалительного процесса, назначения рациональной терапии и определения ее эффективности.
Разнообразие клинического материала и своеобразие микрофлоры отдельных органов определяют особенности методов бактериологического исследования, которые требуют применения специальных приемов отбора проб, посевов на питательные среды и проведения хода анализов.
Бактериологическое исследование клинического материала состоит из нескольких этапов:
— отбор проб на исследование;
— посев на питательные среды;
— выделение чистой культуры;
— идентификация и дифференциация выделенных культур микроорганизмов;
— анализ результатов исследования.
При бактериологическом исследовании проводят так называемый посев собранного у больного материала на питательные среды, что способствует росту и размножению возбудителя заболевания. В ходе исследования можно выявить не только сам факт наличия, но и концентрацию патогенных микроорганизмов в том или ином биоматериале.
Методом бактериологического исследования исследуют мокроту, ликвор, кровь, а также отделяемое из половых органов, ротовой полости, зева и ран пациента. Таким образом, микроорганизмы можно высевать практически с любого участка организма человека.
Методика бактериологического посева чрезвычайно удобна и эффективна для обнаружения и определения вида бактерий и грибков. Определенную сложность представляет обнаружение вирусов в связи с особенностями их биологии.
Бактериологическое исследование (посевы) имеет огромное значение не только для определения конкретного типа микроорганизма, но и установления степени чувствительности к нему того или иного антибиотика. Таким образом, определяется максимальная эффективность того или иного вида антибиотикотерапии.
При проведении анализа важно помнить, что некоторые микроорганизмы, например пневмококки, довольно быстро погибают, поскольку имеют повышенную тенденцию к саморазрушению. Таким образом, посевы необходимо делать в короткие сроки.
Диагностика инфекционных заболеваний
Диагностика инфекционных заболеваний является одной из самых сложных проблем в клинической медицине. Лабораторные методы исследования при ряде нозологических форм играют ведущую, а в целом ряде клинических ситуаций решающую роль не только в диагностике, но и в определении конечного исхода заболевания.
У одних пациентов для диагностики этиологии инфекционно-воспалительного процесса достаточно провести бактериологическое исследование, в других клинических ситуациях решающее значение имеют данные серологических исследований, в третьих, предоставить полезную информацию может только метод ПЦР. Однако наиболее часто в клинической практике врачу-клиницисту необходимо использовать данные различных методов лабораторных исследований.
Бактериологические методы исследования
Бактериологические исследования наиболее часто проводят при подозрении на гнойно-воспалительные заболевания (составляют 40-60% в структуре хирургических заболеваний) с целью их диагностики, изучения этиологической структуры, определения чувствительности возбудителей к антибактериальным препаратам. Результаты бактериологических анализов способствуют выбору наиболее эффективного препарата для антибактериальной терапии, своевременному проведению мероприятий для профилактики внутрибольничных инфекций.
Возбудителями гнойно-воспалительных заболеваний являются истинно-патогенные бактерии, но наиболее часто условно-патогенные микроорганизмы, входящие в состав естественной микрофлоры человека или попадающие в организм извне. Истинно-патогенные бактерии в большинстве случаев способствуют развитию инфекционного заболевания у любого здорового человека. Условно-патогенные микроорганизмы вызывают заболевания преимущественно у людей с нарушенным иммунитетом.
Бактериологические исследования при заболеваниях, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, направлены на выделение всех микроорганизмов, находящихся в патологическом материале, что существенно отличает их от аналогичных исследований при заболеваниях, вызванных истинно патогенными микроорганизмами, когда проводится поиск определенного возбудителя.
Для получения адекватных результатов бактериологического исследования при гнойно-воспалительных заболеваниях особенно важно соблюдать ряд требований при взятии биоматериала для анализа, его транспортировки в лабораторию, проведения исследования и оценки его результатов.
Доставленный в бактериологическую лабораторию биоматериал первоначально подвергается микроскопическому исследованию.
Микроскопическое исследование мазка (бактериоскопия), окрашенного по Граму или другими красителями, проводят при исследовании мокроты, гноя, отделяемого из ран, слизистых оболочек (мазок из цервикального канала, зева, носа, глаза). Результаты микроскопии позволяют ориентировочно судить о характере микрофлоры, ее количественном содержании и соотношении различных видов микроорганизмов в биологическом материале, а также дают предварительную информации об обнаружении этиологически значимого инфекционного агента в данном биоматериале, что позволяет врачу сразу начать лечение (эмпирическое). Иногда микроскопия позволяет выявить микроорганизмы, плохо растущие на питательных средах. На основании данных микроскопии проводят выбор питательных сред для выращивания микробов, обнаруженных в мазке.
Культивирование микроорганизмов. Посев исследуемого биоматериала на питательные среды производят с целью выделения чистых культур микроорганизмов, установления их вида и определения чувствительности к антибактериальным препаратам. Для этих целей используют различные питательные среды, позволяющие выделить наибольшее количество видов микроорганизмов. Оптимальными являются питательные среды, содержащие кровь животного или человека, а также сахарный бульон, среды для анаэробов. Одновременно производят посев на дифференциально-диагностические и селективные (предназначенные для определенного вида микроорганизмов) среды. Посев осуществляют на стерильные чашки Петри, в которые предварительно заливают питательную среду для роста микроорганизмов.
Микроскопия мазков, окрашенных по Граму
Чашки Петри с посевами инкубируют в термостате при определенных температурных, а для ряда микроорганизмов газовых (например, для выращивания анаэробов создают условия с низким содержанием кислорода) режимах в течение 18-24 часов. Затем чашки Петри просматривают. Количественную обсемененность доставленного биоматериала микрофлорой определяют по числу колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл или 1 мг исследуемого образца. При просмотре чашек Петри выявляют некоторые особенности изменения цвета среды, ее просветления в процессе роста культуры. Многие группы бактерий образуют характерные формы колоний, выделяют пигменты, которые окрашивают колонии или среду вокруг них. Из каждой колонии делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Оценивают однородность бактерий, форму и размер, наличие спор или других включений, капсулы, расположение бактерий, отношение к окраске по Граму. Вся эта информация служит важнейшей составляющей для выбора сред и получения в дальнейшем чистой культуры каждого микроорганизма.
Колонии отсевают на плотные, жидкие, полужидкие питательные среды, оптимальные для культивирования определенного вида бактерий.
Выделенные чистые культуры микроорганизмов подвергают дальнейшему изучению в диагностических тестах, основанных на морфологических, ферментативных, биологических свойствах и антигенных особенностях, характеризующих бактерий соответствующего вида или варианта.
Определение чувствительности к антибактериальным препаратам. Чувствительность к антимикробным препаратам изучают у выделенных чистых культур микроорганизмов, имеющих этиологическое значение для данного заболевания. Поэтому в направлении на бактериологические анализы требуется указать диагноз заболевания у больного. Определение чувствительности бактерий к спектру антибиотиков помогает лечащему врачу правильно выбрать препарат для лечения больного.
Установить этиологическую роль условно-патогенной микрофлоры помогают также нарастание количества и повторность выделения бактерий одного вида от больного в процессе заболевания.
Врач-клиницист должен знать, что положительный результат бактериологического исследования в отношении биологического материала, полученного из в норме стерильного очага (кровь, плевральная жидкость, спинномозговая жидкость, пунктат органа или ткани), всегда тревожный результат, требующий немедленных действий по оказанию медицинской помощи.
Серологические методы исследования
В основе всех серологических реакций лежит взаимодействие антигена и антитела. Серологические реакции используются в двух направлениях.
1. Обнаружение с диагностической целью антител в сыворотке крови обследуемого. В этом случае из двух компонентов реакции (антитело, антиген) неизвестным является сыворотка крови, так как постановка реакции проводится с заведомо известными антигенами. Положительный результат реакции свидетельствует о наличии в крови антител, гомологичных применяемому антигену; отрицательный результат указывает на отсутствие таковых. Достоверные результаты получают при исследовании «парных» сывороток крови больного, взятой в начале заболевания (3-7-й день) и через 10-12 дней. В этом случае удается наблюдать динамику нарастания антител. При вирусных инфекциях лишь четырехкратное и большее повышение титра антител во второй сыворотке имеет диагностическое значение.
С внедрением в практику лабораторий метода иммуноферментного анализа (ИФА) стало возможным определять в крови больных антитела, относящиеся к различным классам иммуноглобулинов (IgM и IgG), что существенным образом повысило информативность серологических методов диагностики. При первичном иммунном ответе, когда иммунная система человека взаимодействует с инфекционным агентом в первый раз, синтезируются преимущественно антитела, относящиеся к иммуноглобулинам класса М. Лишь позднее, на 8-12 день после попадания антигена в организм, в крови начинают накапливаться антитела иммуноглобулинов класса G. При иммунном ответе на инфекционные агенты вырабатываются также и антитела класса А (IgA), которые играют важную роль в защите от инфекционных агентов кожи и слизистых оболочек.
2. Установление родовой и видовой принадлежности микроба или вируса. В этом случае неизвестным компонентом реакции является антиген. Такое исследование требует постановки реакции с заведомо известными иммунными сыворотками.
Серологические исследования не обладают 100%-й чувствительностью и специфичностью в отношении диагностики инфекционных заболеваний, могут давать перекрестные реакции с антителами, направленными к антигенам других возбудителей. В связи с этим оценивать результаты серологических исследований необходимо с большой осторожностью и учетом клинической картины заболевания. Именно этим обусловлено использование для диагностики одной инфекции множества тестов, а также применение метода Western-blot для подтверждения результатов скрининговых методов.
В последние годы прогресс в области серологических исследований связан с разработкой тест-систем для определения авидности специфических антител к возбудителям различных инфекционных заболеваний.
Затем развитие иммунного процесса постепенно (это могут быть недели или месяцы) идет в сторону синтеза лимфоцитами высокоспецифичных (высокоавидных) IgG-антител, более прочно связывающихся с соответствующими антигенами. На основании этих закономерностей иммунного ответа организма в настоящее время разработаны тест-системы для определения авидности специфических IgG-антител при различных инфекционных заболеваниях.
Высокая авидность специфических IgG-антител позволяет исключить недавнее первичное инфицирование и тем самым с помощью серологических методов установить период инфицирования пациента. В клинической практике наиболее широкое распространение нашло определение авидности антител класса IgG при токсоплазмозе и цитомегаловирусной инфекции, что дает дополнительную информацию, полезную в диагностическом и прогностическом плане при подозрении на эти инфекции, в особенности при беременности или планировании беременности.
Метод полимеразной цепной реакции
Полимеразная цепная реакция (ПЦР), являющаяся одним из методов ДНК-диагностики, позволяет увеличить число копий детектируемого участка генома (ДНК) бактерий или вирусов в миллионы раз с использованием фермента ДНК-полимеразы. Тестируемый специфический для данного генома отрезок нуклеиновой кислоты многократно умножается (амплифицируется), что позволяет его идентифицировать.
Сначала молекула ДНК бактерий или вирусов нагреванием разделяется на 2 цепи, затем в присутствии синтезированных ДНК-праймеров (последовательность нуклеотидов специфична для определяемого генома) происходит связывание их с комплементарными участками ДНК, синтезируется вторая цепь нуклеиновой кислоты вслед за каждым праймером в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы. Получается две молекулы ДНК. Процесс многократно повторяется. Для диагностики достаточно одной молекулы ДНК, то есть одной бактерии или вирусной частицы.
Посев на микрофлору отделяемого ЛОР-органов с идентификацией микроорганизмов, в т.ч. кандида, методом времяпролетной МАСС-спектрометрии (MALDI-TOF) и определением чувствительности к основному спектру антибиотиков и антимикотиков
Описание
Посев на микрофлору отделяемого ЛОР-органов и тканей с определением чувствительности к основному спектру антибиотиков — это бактериологическое исследование, с помощью которого определяется количественный и качественный состав микрофлоры и её чувствительность к основному спектру антибиотиков.
Суть метода заключается в посеве исследуемого материала на питательные среды с целью выявления и идентификации чистой культуры возбудителя.
Микрофлора верхних дыхательных путей
В верхние дыхательные пути попадают пылевые частицы, нагруженные микроорганизмами, большая часть которых задерживается и погибает в носо- и ротоглотке. Здесь присутствуют бактероиды, коринеформные бактерии, гемофильные палочки, лактобактерии, стафилококки, стрептококки, нейссерии, пептококки. Трахея, бронхи, и альвеолы обычно стерильны.
Инфекционные заболевания
Инфекционные заболевания вызывают патогенные и условно-патогенные микроорганизмы. К условно-патогенным относят представителей нормальной микрофлоры человека, так как эволюционно они сохранили способность к паразитическому образу жизни. В отличие от патогенных микроорганизмов, они проявляют свои свойства при условии снижения сопротивляемости организма.
Определение чувствительности к антибиотикам проводится при выявлении роста 10 2 и более КОЕ/мл.
Определение дрожжеподобных грибов рода Candida и постановка чувствительности к антимикотическим средствам входит в данный анализ.
Интерпретация результатов
Интерпретация результатов исследования содержит информацию для лечащего врача и не является диагнозом. Информацию из этого раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. Точный диагноз ставит врач, учитывая результаты данного обследования и данные анамнеза, результатов других обследований и т.д.
На бланке результата указывается наличие или отсутствие роста; степень бактериурии, выраженная в КОЕ/мл, наименование возбудителя; степень бактериурии, выраженная в КОЕ/мл; чувствительность к антимикробным препаратам (определяется при бактериурии в титре более 104 КОЕ/мл).
В норме — рост микробной флоры отсутствует. При выделении ассоциации бактерий 10 5 КОЕ/мл и более является критическим. Повышение уровня говорит с большей вероятностью о развитии гнойной инфекции или генерализации процесса. При обсеменённости менее 10 5 КОЕ/мл раны заживают без явлений нагноения.
Внимание!
При обнаружении роста нормальной, сопутствующей и условно-патогенной флоры в низком титре, и не имеющей диагностического значения, определение чувствительности к антимикробным препаратам не проводится.
В чем заключается исследования выделенных органов в питательной среде
В настоящее время технология культивирования клеток млекопитающих стала одним из основных направлений, без которого невозможен научный прогресс в биологии, медицине и фармакологии. Изучение культур клеток животных и человека позволяют исследовать механизмы клеточного взаимодействия, дифференцировки и дедифференцировки клеток, трансдукцию сигналов, а также реакцию клеток на внешнее воздействие и многое другое. Кроме того, клеточные и тканевые культуры используют в качестве модельных систем для изучения механизмов патогенеза при различных заболеваниях, для оценки эффективности и токсичности новых лекарственных средств, они применяются для производства вакцин и биофармацевтических препаратов, задействованы во вспомогательных репродуктивных технологиях. С каждым годом во всем мире растет популярность нового направления, регенеративной медицины, основанной на технологии культивирования клеток человека [1]. Независимо от назначения клеточной культуры, для поддержания стабильного роста и размножения клеток ключевым фактором является выбор соответствующей питательной среды, способной обеспечить клетки элементами питания, метаболитами, необходимыми для биосинтеза, регуляторными факторами, веществами, способными выполнять защитные функции. Кроме того, культуральная среда непосредственно влияет на результаты исследований, скорость производства биофармацевтических препаратов или соответствие полученной культуры медицинским требованиям. Таким образом, целью данной статьи является обзор наиболее часто применяемых питательных сред, их классификации, состава и необходимости внесения дополнительных компонентов для создания оптимальных условий при культивировании клеток млекопитающих.
Классификация питательных сред
Со момента появления первых сообщений, посвященных культивированию клеток, тканей или органов вне живого организма, исследователей занимал вопрос о составе питательной среды, достаточном для поддержания жизнеспособности клеток и возможности их пролиферации [1–3]. И несмотря на огромный выбор коммерческих сред и добавок для выращивания клеток в искусственных условиях, проблема выбора питательной среды до сих пор не утратила актуальности [4–6].
Классически питательные среды, используемые для культивирования клеток животных, подразделяют на естественные (или природные) и искусственные (или синтетические). К естественным питательным средам относятся биологические жидкости (плазма, сыворотка, лимфа, сыворотка пуповинной крови человека, амниотическая жидкость), тканевые экстракты (экстракт печени, селезенки, костный мозг, экстракты бычьего и куриного эмбрионов), коагуляты или сгустки плазмы крови. Искусственные среды подразделяются на сбалансированные солевые растворы, образующие основу для комплексных сред (фосфатно-солевой буфер – PBS, фосфатный буфер Дульбекко – DPBS, раствор Хэнкса – HBSS, раствор Эрла – EBSS), основные или минимальные среды (MEM, DMEM) и комплексные среды (RPMI-1640, IMDM, F-10 и F-12 Хэма) [1, 6].
Естественные среды очень удобны, эффективны и подходят для культивирования широкого спектра культур клеток животных. Однако основными недостатками таких сред являются низкая воспроизводимость из-за варьирования компонентов в разных партиях и отсутствие информации об их точном составе. Искусственные или синтетические среды получают путем объединения питательных веществ (как органических, так и неорганических), витаминов, солей, сывороточных белков, углеводов, кофакторов. В настоящее время разработаны различные искусственные среды, обеспечивающие выполнение одной или нескольких задач, таких как поддержание жизнеспособности, длительное культивирование, неограниченный рост культуры или специализированные функции. Клетки животных можно культивировать, используя исключительно естественную питательную среду или искусственную среду с добавлением натуральных компонентов [1, 6].
В зависимости от состава искусственные среды также классифицируют на среды, содержащие сыворотку, бессывороточные среды, безбелковые среды и химически определенные среды.
Бессывороточные среды (serum-free media) были разработаны для устранения недостатков, связанных с влиянием сыворотки на конечный результат эксперимента, например при интерпретации в иммунологических исследованиях [7]. Как правило, они предназначены для культур, состоящих из клеток одного типа (например, Knockout Serum Replacement и Knockout DMEM от Thermo Fisher Scientific для стволовых клеток) и включают определенные количества очищенных факторов роста, протеинов и липопротеинов, источником которых традиционно является сыворотка [8]. Такие среды относятся к «определенным культуральным средам», так как их компоненты известны. В случае, когда бессывороточные среды дополняют фракциями общего белка (бычьего сывороточного альбумина, α- или β-глобулина), они относятся к «химически неопределенным средам» [1, 5].
Безбелковые среды (protein-free media) не содержат высокомолекулярные протеины, но могут включать пептидные фракции (гидролизаты белков) [1]. По сравнению со средами, дополненными сывороткой, применение безбелковых сред способствует активному росту клеток и экспрессии белка, а также облегчает последующую очистку любого экспрессированного продукта, например моноклональных антител [5, 9]. Примерами безбелковых сред могут служить MEM и RPMI-1640, которые при необходимости могут быть дополнены белковыми компонентами.
В состав химически определенных сред (chemically defined media) не входят белковые фракции, гидролизаты или экстракты тканей, такие среды включает только химически чистые, не содержащие примеси неорганические и органические компоненты. В их состав могут входить белковые добавки, такие как факторы роста, продуцируемые в бактериях или дрожжах генноинженерным способом с последующим добавлением витаминов, холестерина, специфических аминокислот и жирных кислот [1, 5, 6].
Некоторые авторы также выделяют среды, не содержащие чужеродных компонентов (xeno-free media или animal-derived component-free media), в состав которых входят только соединения человеческого, но не животного происхождения (например, сывороточный альбумин человека) [10]. При этом среды, не содержащие компоненты животного происхождения, могут включать бактериальные, дрожжевые гидролизаты или растительные экстракты [1, 5].
Компоненты питательной среды
Выбор питательной среды непосредственно влияет на возможность длительного поддержания клеток в культуре, способность клеток активно пролиферировать, экспрессировать целевой продукт или выполнять какую-либо функцию. В связи с этим при планировании эксперимента, а также при подборе питательной среды и условий культивирования необходимо учитывать особенности и функции компонентов, составляющих ее основу, чем и определяется неослабевающий интерес исследователей к потребностям клеток в питательных элементах и к возможности их восполнения культуральной средой [11–13].
Состав питательных сред варьирует в зависимости от типа клеток, для культивирования которых среда была разработана, от функционального назначения среды и от представлений ее составителя о потребностях клеток, выращиваемых в искусственных условиях. Однако обязательные компоненты, обеспечивающие жизнеспособность клеток вне живого организма, присутствуют со всех составах коммерческих сред.
Буферная система. Поддержание оптимального уровня рН является обязательным условием культивирования клеток in vitro. Наиболее распространенными являются два типа буферных систем – на основе бикарбоната натрия и на основе HEPES.
Бикарбонатная буферная система обеспечивает постоянный уровень рН равновесным соотношением между бикарбонатом натрия (NaHCO3) в культуральной среде и CO2 в инкубаторе, при этом она является недорогой и нетоксичной для клеток. В результате повышения концентрации CO2 в газовой фазе увеличивается количество CO2, растворенного в питательной среде, что ведет к росту концентрации H2CO3 и понижению рН. Напротив, если концентрация CO2 газовой фазы снижена, то рН повышается за счет обратной реакции [4, 14]. Как правило, теоретически оптимальной концентрацией СО2 в инкубаторе считается 5–6 %, однако фактически она должна регулироваться в зависимости от концентрации NaHCO3 в культуральной среде. Например, уровень СО2 5 % адекватен при содержании в среде 26 ммоль/л NaHCO3 (среда MEM), 2 % CO2 соответствует 14 ммоль/л NaHCO3 (среда F-12 Хэма), 10 % CO2 – 44 ммоль/л NaHCO3 (среда DMEM) [11]. Эти величины являются теоретическими значениями, вычисленными при помощи уравнения Хендерсона – Хассельбаха
(pH = pKa + log[HCO3−]/[CO2](жидкой фазы),
где pKa – отрицательный логарифм константы кислотной диссоциации), на практике рекомендуется проверять pH питательной среды после достижения равновесия, а затем корректировать концентрацию CO2 [1, 15].
HEPES или (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота) обладает большей буферной емкостью, чем бикарбонатная система, и обеспечивает стабильный уровень рН среды в диапазоне рН 7,2–7,4 даже в условиях культивирования клеток вне CO2 инкубатора. Применение HEPES также целесообразно при поддержании культур с высокой плотностью клеток, когда рН быстро снижается вследствие накопления метаболитов, например лактата, и в случае использования бессывороточных сред, лишенных буферного воздействия сыворотки [6, 14]. В то же время буферная система на основе HEPES является более дорогостоящей и может оказывать негативное влияние на определенные типы клеток, такие как эпифизарные хондроциты куриных эмбрионов и эмбриональные стволовые клетки [16]. Также было показано, что HEPES повышает чувствительность среды к фототоксическим эффектам, индуцированным воздействием флуоресцентного света, усиливая генерацию цитотоксичных продуктов, в основном перекиси водорода [17]. Поэтому при использовании буферной системы, основанной на HEPES, следует тестировать воздействие буфера на культивируемые клетки.
Феноловый красный. Большинство предлагаемых коммерческих сред содержат феноловый красный в качестве индикатора рН, что позволяет непрерывно отслеживать уровень кислотности культуральной среды. При низком уровне рН феноловый красный становится желтым, тогда как при высоких уровнях рН он имеет пурпурную окраску, ярко-красный цвет среды соответствует рН 7,4, оптимальному для культивирования клеток животных [1, 11]. Однако добавление индикатора в среды имеет ряд недостатков: 1. Феноловый красный имитирует действие стероидных гормонов, например эстрогена, что оказывает влияние на пролиферацию некоторых клеток млекопитающих [18]. 2. Присутствие фенолового красного в ряде бессывороточных композиций нарушает калий-натриевый гомеостаз, однако этот эффект можно нейтрализовать, включив в состав среды сывороточный или бычий гормон гипофиза. 3. Феноловый красный может искажать результаты в исследованиях, основанных на проточной цитометрии. Поэтому при его добавлении в среду следует проверять, оказывает ли он какое-либо воздействие на культивируемые клетки и на эмпирические результаты, особенно при работе с чувствительными к эстрогену клетками, такими как клетки молочной железы [6, 18].
Неорганические соли в средах способствуют поддержанию осмотического баланса и помогают регулировать мембранный потенциал [6]. Основными ионами, входящими в состав культуральных сред являются Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl−, SO42–, PO43− и HCO3 [12]. Кальций (
10−3 M) обеспечивает адгезию клеток к субстрату, и в средах, предназначенных для суспензионных культур, его концентрация снижена. Кроме того, он играет роль в сигнальной трансдукции, и концентрация этого иона является определяющей для размножения или дифференцировки клеток. Магний (
10–4 M) является ключевым ионом для поддержания активности ряда ферментов, он также влияет на стабильность мембраны. Натрий (
10–1 M) ответственны за мембранный потенциал клеток, тогда как анионы фосфата (
10–6 M) и гидрокарбоната (
10–2 М) необходимы для синтеза внеклеточного матрикса и играют роль в регуляции внутриклеточного заряда [4, 14].
Углеводы в форме сахаров являются основным источником энергии для культивируемых клеток. Наиболее распространенным элементом питания в коммерческих средах является глюкоза [11], однако некоторые могут содержать галактозу, мальтозу или фруктозу [4, 6]. В зависимости от метаболической активности клеток и скорости их пролиферации для поддержания культур некоторых типов клеток требуется большее количество питательных веществ. Такие особенности культуры следует учитывать при выборе среды. Например, среда DMEM изначально содержала 5,6 ммоль/л глюкозы, но сейчас для клеток с активным метаболизмом доступен модифицированный вариант с повышенной концентрацией глюкозы, 25 ммоль/л. Однако применение этой среды для культивирования активно пролиферирующих клеток может приводить к быстрому накоплению в среде таких метаболитов, как лактат (в искусственной среде клетки получают энергию преимущественно за счет гликолиза), что вызывает снижение рН раствора [11]. В данном случае рекомендуется более частая замена среды или использование буферной системы HEPES, обладающей большей буферной емкостью [1].
Аминокислоты входят в состав белков, что определяет их обязательное присутствие во всех средах; они необходимы для пролиферации клеток, поэтому их концентрация определяет максимальную плотность, которую культура может достичь [13, 14]. Так как клетки неспособны синтезировать незаменимые аминокислоты, они должны быть включены в состав питательной среды, в отличие от заменимых аминокислот, которые, как правило, не входят в состав основных сред (BME и MEM). Однако не все типы клеток способны синтезировать достаточное количество заменимых аминокислот в искусственных условиях. Поэтому внесение их в питательную среду (например, среда F-12 Хэма) может обеспечить благоприятные условия для роста и размножения клеток, а также позволяет снизить биосинтетическую нагрузку на клетки, способные синтезировать аминокислоты с необходимой для поддержания жизнедеятельности скоростью. Особое внимание следует уделять аминокислотам с разветвленной цепью, валину, лейцину и изолейцину. Все они относятся к группе незаменимых аминокислот, и для культивирования некоторых типов клеток, включая человеческие фибробласты и клетки мышиной миеломы, необходима высокая их концентрация. Для данных культур рекомендуется своевременная замена среды или дополнительное внесение аминокислот в процессе культивирования [1].
Особенно важна для культивируемых клеток такая аминокислота, как L-глутамин. Он обеспечивает клетки азотом, необходимым для НАД, НАДФН, биосинтеза нуклеотидов и белков, а также служит дополнительным источником энергии для метаболизма (участвуя в цикле лимонной кислоты) [11, 13]. Потребность клеток в этой аминокислоте в 3–40 раз (в зависимости от типа клеток) превышает потребность в других аминокислотах; добавление глутамина необходимо при культивировании клеток, требовательных к повышенному содержанию питательных компонентов в среде [2]. Однако стоит учитывать, что глутамин стабилен приблизительно в течение 3 недель при 4ºС [19] и легко разлагается в среде с образованием аммиака, оказывающего токсическое воздействие на клетки [11, 20, 21], поэтому предпочтительным является добавление глутамина к среде непосредственно пред употреблением или использованием его производных, более устойчивых к деградации, таких как L-аланил-L-глутамин или глицил-L-глутамин [1, 4]. Эти дипептиды, известные также под коммерческим названием GLUTAMAX™, более термостабильны, чем глутамин, и могут выдерживать стерилизацию автоклавированием [22]. В клетках они расщепляются пептидазами, высвобождая глутамин и аланин или глицин, поэтому доступность глутамина зависит от пептидазной активности клеток, что определяет его невысокую внутриклеточную концентрацию и снижает риск образования токсичных количеств аммиака [5]. Таким образом, дипептиды могут заменять глутамин при длительном культивировании медленно растущих клеточных культур.
Витамины необходимы в качестве предшественников различных кофакторов для пролиферации и роста клеток. Витамины группы B наиболее часто вносят в культуральные среды для стимулирования роста [6], витамины С и Е обладают антиоксидантными свойствами [1]. По большей части водорастворимые витамины (B1, B2, B6, B12, C, фолиевая кислота) присутствуют в основных средах [12]; что касается жирорастворимых витаминов (A, D, E, K), то их состав и количество часто ограничены, в достаточных концентрациях они присутствуют только в сложных средах, таких как среда 199, RPMI 1640 [4, 14]. Основным недостатком добавления витаминов в питательные среды является их нестабильность: витамины A, C, D и E быстро деградируют при окислении кислородом воздуха, кроме того, витамин С окисляется в результате реакции с микроэлементами, что может сопровождаться генерацией активных форм кислорода. На скорость распада витаминов A, B1, B2, B12, C и K также влияет свет, деградации витаминов B1 и B5 способствует повышение температуры. Фолаты отличаются слабой растворимостью и в некоторых случаях могут быть частично удалены из среды во время стерилизации фильтрацией. Гидроксокобаламин и аскорбиновая кислота взаимодействуют, способствуя взаимной деградации [1].
Сыворотка животных представляет собой сложный комплекс высокомолекулярных и низкомолекулярных биомолекул с различными, физиологически сбалансированными стимулирующими и ингибирующими рост активностями [23]. Широкое распространение в технологии культивирования клеток получили сыворотки взрослых (лошадиная сыворотка), новорожденных животных (телячья сыворотка) или эмбриональные сыворотки (эмбриональная или фетальная бычья сыворотка – FBS). Последняя на сегодняшний день является наиболее популярной и повсеместно используемой сывороткой. Эмбриональная бычья сыворотка богата факторами роста и содержит низкий уровень γ-глобулинов (которые обладают ингибирующей рост клеток активностью), поэтому она подходит как для клонирования клеток, так и для поддержания пролиферации клеток, выращивание которых в искусственных условиях вызывает трудности. Телячья сыворотка, напротив, обладает слабой стимулирующей рост активностью, поэтому используется в основном для изучения контактного ингибирования или при исследовании клеточной дифференциации, когда факторы роста могут искажать результат [4, 7]. Еще она причина, по которой сыворотка теленка может оказаться предпочтительнее эмбриональной сыворотки, это содержание липидов, которое повышается в сыворотке после рождения с течением времени, поэтому при культивировании клеток, требующих высокого содержания липидов, выбирают телячью сыворотку или сыворотку взрослого быка [1]. Лошадиная сыворотка, получаемая от взрослых лошадей, характеризуется сравнительно высокой однородностью разных партий. Она отличается низкой концентрацией полиаминоксидазы [24], участвующей в синтезе полиаминов, которые стимулируют пролиферацию клеток и медленно метаболизируются [1, 25].
Состав сыворотки животного происхождения очень сложен, многообразен и может варьировать в зависимости от лота, партии или фирмы – производителя продукта. К компонентам, идентифицированным в сыворотке, относятся следующие биомолекулы [1, 6, 23]:
− белки, среди которых выделяют сывороточные белки (альбумин, глобулины, в том числе иммуноглобулины), транспортные белки (трансферрин, транскортин, липопротеины α1 и β1), ингибиторы протеаз (α1-антитрипсин и α2-макроглобулин), факторы прикрепления (фибронектин, ламинин) и факторы распространения, а также ферменты (лактатдегидрогеназа, щелочная фосфатаза, γ-глутамилтрансфераза и др.);
− небелковые соединения, содержащие азот (пурины и пиримидины, аминокислоты, полиамины, креатинин, мочевина);
− углеводы (глюкоза, галактоза, фруктоза, манноза, рибоза);
− гормоны (инсулин, глюкагон, соматотропин, кортикостероиды, тиреоидные и паратиреоидные гормоны, андрогены, эстроген, прогестерон, пролактин, фолликулостимулирующий гормон, вазопрессин, простагландины и др.);
− факторы роста и цитокины (эпидермальный фактор роста – EGF, фактор роста фибробластов – FGF, инсулиноподобный фактор роста – IGF, фатор роста нервной ткани – NGF, фактор роста тромбоцитов – PDGF, трансформирующий фатор роста – TGF, фактор роста эндотелиальных клеток – ECGF, интерлейкины, интерфероны);
− липиды и жирные кислоты, свободные или связанные с белками (холестерин, стероиды, этаноламин, холин, инозитол, фосфолипиды, триглицериды; пальмитат, стеарат, олеат, линолеат и другие);
− витамины (водорастворимые – B1, B2, B6, B12, C, фолиевая кислота, биотин, никотиновая кислота, пантотеновая кислота; жирорастворимые – A, D, E, K);
− микроэлементы (Fe, Zn, Cu, Cr, I, Co, Se, Mn, Mo и др.).
Многокомпонентный состав сыворотки определяет множественность выполняемых ею функций: она обеспечивает клетки элементами питания, стимулирует их рост и пролиферацию, способствует прикреплению к субстрату и распространению по всему объему культурального сосуда; повышая вязкость среды, сыворотка защищает культуру от механических повреждений при перемещении или пипетировании, протеазы обеспечивают защиту клеток от лизиса; кроме того, сыворотка увеличивает буферную емкость среды. Как правило, в питательные среды вносят от 2 % до 15 % сыворотки [6, 7, 9].
Однако, несмотря на значение сыворотки для поддержания жизнеспособности клеток в искусственных условиях, ее применение имеет ряд недостатков [23, 25, 26], таких как низкая воспроизводимость результатов вследствие варьирования состава разных лотов, возможность присутствия в сыворотке факторов, ингибирующих рост клеток, увеличение риска контаминации (например, вирусами). Также добавление сыворотки может влиять на производимый клетками продукт и препятствовать его дальнейшей очистке [9]. В случаях, когда применение сыворотки является нежелательным, исследователи могут использовать так называемые заменители сыворотки [8, 27]. Они включают экстракты сыворотки, экстракты тканей или гидролизаты [10], в том числе лизаты тромбоцитов факторы роста [28, 29], гормоны, белки-переносчики (альбумин и трансферрин), липиды, металлы, витамины, полиамины и восстановители (2-меркапоэтанол, α-тиоглицерин, восстановленный глутатион) [30, 31]. Количество комбинаций этих соединений практически бесконечно, при этом они, как правило, взаимодействуют друг с другом. Их подбор требует огромных усилий, времени и затрат, так как невозможно составить оптимальную среду, добавляя вещества случайным образом и в произвольных комбинациях. Коммерческие бессывороточные и безбелковые среды показывают хорошие результаты при культивировании клеток [32], однако их состав почти никогда не раскрывается и их нельзя отнести к «химически определенным».
Антибиотики в процессе культивирования клеток млекопитающих используются для сдерживания роста бактериальных и грибковых контаминантов, особенно в процессе получения первичных культур [33]. Наиболее распространенными антибиотиками являются: пенициллин (100 ед/мл; ингибирование синтеза клеточной стенки бактерий), стрептомицин (100 мкг/мл; влияние на синтез белка), гентамицин (50 мкг/мл; ингибирование синтеза белка) [4, 19]. Из антимикотиков чаще применяют амфотерицин В (2,5 мкг/мл; нарушение барьерной функции мембраны). Однако регулярное применение антибиотиков может привести к развитию резистентности у бактерий, а также препятствует обнаружению в культуре контаминантных микоплазм [19]. Кроме того, антибиотики могут влиять на метаболизм чувствительных клеток. В связи с этим общей рекомендацией является строгое соблюдение правил асептики и отказ от регулярного использования антибиотиков в рутинных процедурах культивирования клеток [4, 6, 14].
Выбор культуральной среды
Каждый вид питательной среды был разработан для определенного типа клеток, в соответствии с их происхождением (видом животного) и целью культивирования. Среды MEM, DMEM или F-12 Хэма, как правило, применяют для поддержания адгезионных клеточных культур, среду RPMI 1640 – для суспензионных культур. Еще одним значимым вопросом при выборе среды является вопрос о добавлении природных компонентов. Например, MEM (предложенная Иглом) была разработана с учетом добавления сыворотки и потому содержит только минимально необходимые компоненты (неорганические соли, сахар, незаменимые аминокислоты и водорастворимые витамины), тогда как среда 199 и среда Хэма F-12, предназначенные для культивирования клеток без сыворотки, имеют более сложный состав. Ниже приведены типы клеток и клеточных линий, для культивирования которых можно использовать наиболее распространенные питательные среды [1, 6]:
MEM (минимальная питательная среда Игла) содержит сбалансированный солевой раствор, заменимые аминокислоты и пируват натрия, подходит для культивирования эмбриональных фибробластов цыплят, клеток яичника китайского хомячка, эмбриональных нервных клеток, альвеолярных клеток, эндотелиальных, эпидермальных клеток, фибробластов, глиальных клеток, клеток глиомы, меланомы, опухолевых клеток человека;
DMEM (модифицированная Дульбекко среда Игла) отличается от EMEM более высокой концентрацией аминокислот (примерно в 2 раза) и витаминов (в 4 раза), а также содержит нитрат железа, пируват натрия и несколько дополнительных аминокислот. Данную среду первоначально использовали для культур эмбриональных стволовых клеток мыши, однако впоследствии ее применяли для широкого спектра животных клеток и клеточных линий: для эндотелиальных клеток, эмбриональных альвеолярных клеток, клеток цервикального эпителия, клеток желудочно-кишечного тракта, клеток щитовидной железы свиньи, клеток скелетных мышц, клеток Сертоли, фибробластов сирийского хомяка, клеток мышиной нейробластомы, клеточных линий на основе клеток, полученных от пациентов с раком яичников;
RPMI-1640 (среда, разработанная в Мемориальном институте Розуэлл Парка для лимфоцитов периферической крови) используется для культивирования Т-клеток и тимоцитов, стволовых гемопоэтических клеток, клеток печени крыс, мышиных гибридом, опухолевых клеток человека, линий клеток миелоидной лейкемии и лимфобластного лейкоза человека, клеток миеломы мыши, клеток лейкемии и эритролейкемии мыши.
Комплексные среды F-10 и F-12 Хэма первоначально были созданы для поддержания клонального роста клеток яичника китайского хомяка (CHO), при этом среда Хэма F-12, дополненная 25 мМ HEPES, обладает улучшенными буферными свойствами. Данные среды могут применяться для выращивания клеток пигментированной сетчатки куриного эмбриона, клеток костной, хрящевой и жировой тканей, эмбриональных клеток легких, клеток скелетных мышц.
IMDM (среда Дульбекко, модифицированная Исквым) является исключительно обогащенной синтетической средой, подходящей для быстро пролиферирующих культур клеток с высокой плотностью. Среда представляет собой модификацию DMEM, содержащую селен, дополнительные аминокислоты, витамины и неорганические соли, а также HEPES и пируват натрия. Среда была разработана для культивирования лимфоцитов и гибридом и может использоваться при культивировании клеток костного мозга, стволовых гематопоэтических клеток, линий клеток лимфобластного лейкоза человека.
Заключение
Выбор питательной среды определяет успех культивирования клеток, выбранных в качестве объекта исследования или модельной системы, возможность поддержания жизнеспособной культуры длительное время и способность клеток активно пролиферировать в искусственных условиях. В настоящее время коммерческое разно- образие доступных сред, готовых к употреблению или нуждающихся в незначительных дополнениях, а также сывороток, факторов роста, гормонов и других активных соединений достаточно велико и, при условии правильного выбора или эмпирического подбора наиболее целесообразных компонентов, позволяет обеспечивать стабильное поддержание множества типов клеток или клеточных линий в культуре.