В чем заключается правило егорова
В чем заключается правило егорова
Работа с камерой Горяева
Камера Горяева – оптическое устройство для подсчета клеток или иных соизмеримых с ними частиц в заданном объеме жидкости. Состоит из толстого предметного стекла, имеющего прямоугольное углубление (камеру) с нанесенной микроскопической сеткой и тонкого покровного стекла. Камера разработана профессором Казанского университета Горяевым Н.К. Благодаря увеличенному объему сетки отличается большей точностью подсчета, по сравнению с другими камерами (Тома, Цейса, Тюрка, Бюркера).
Технические характеристики камеры Горяева
Размеры малого квадрата камеры Горяева 0,05×0,05 мм
Размеры большого квадрата камеры Горяева 0,2×0,2 мм
Глубина камеры 0,1 мм
Объем жидкости под 1 малым квадратом 0,00025 мм3 (мкл) = 1/4000 мм3 (мкл)
Объем жидкости под 1 большим квадратом 0,004 мм3 (мкл) = 1/250 мм3 (мкл)
Объем камеры Горяева 0,9 мм3 (мкл)
Описание сетки камеры Горяева
Сетка камеры Горяева состоит из 225 больших квадратов, из которых 25 разделены на 16 малых квадратов.
Рис 1. Сетка камеры Горяева
Рис 2. Большой (1) и малый (2) квадраты сетки камеры Горяева
Рис 3. 225 больших квадратов сетки камеры Горяева
Рис 4. 100 больших квадратов сетки камеры Горяева
Рис 5. Большой квадрат камеры Горяева разделенный на 16 малых квадратов.
Обслуживание камеры Горяева
Между работой камера должна храниться в сухом месте. После работы камера дезинфицируется погружением на 30 минут в 70% раствор этилового спирта, или на 60 минут в 4% раствор формалина, после чего камера промывается дистиллированной водой и протирается мягкой салфеткой.
Правило подсчета клеток в квадрате (правило Егорова)
В квадрате считаются клетки, лежащие внутри его, а также касающиеся левой и верхней границ. Клетки, касающиеся правой и нижней границ при подсчете не учитываются.
Методика подсчета лейкоцитов в камере Горяева
Развести образец исследуемой крови в 20 раз 3–5% раствором уксусной кислоты с метиленовым синим (например, 20 мкл крови и 380 мкл р-ра уксусной к-ты). Камеру и покровное стекло насухо протереть марлей. Недопускается использование для протирки ватных тампонов из-за остающихся на стекле волокон. Аккуратно притереть покровное стекло к камере, слегка надавливая на него до появления цветных колец Ньютона. Заполнить камеру разведенной кровью и выдержать 1 минуту для прекращения движения клеток. При малом увеличении (окуляр ×10, объектив ×8) посчитать лейкоциты в 100 больших квадратах. Расчет числа лейкоцитов осуществляют, исходя из разведения крови (20) и числа больших квадратов (100), по формуле: X = (a×250×20) / 100, где Х – число лейкоцитов в 1 мкл крови; а – число лейкоцитов, посчитанных в 100 больших квадратах камеры Горяева. Практически, после сокращений в формуле, количество посчитанных лейкоцитов умножают на 50.
Методика подсчета эритроцитов в камере Горяева
Развести образец исследуемой крови в 200 раз в 0,9% растворе NaCl или растворе Гайема (берется 20 мкл крови и 4 мл раствора). Камеру и покровное стекло насухо протереть марлей. Недопускается использование для протирки ватных тампонов из-за остающихся на стекле волокон. Аккуратно притереть покровное стекло к камере, слегка надавливая на него до появления цветных колец Ньютона. Заполнить камеру разведенной кровью и выдержать 1 минуту для прекращения движения клеток. При малом увеличении (окуляр ×10, объектив ×8) посчитать эритроциты в 5 больших квадратах разделенных на 16 малых (т.е. в 80 малых квадратах). Рекомендуется считать клетки в квадратах, расположенных по диагонали. Расчет числа эритроцитов осуществляют, исходя из разведения крови (200) и числа малых квадратов (80), по формуле: X = (a×4000×200) / 80, где Х – число эритроцитов в 1 мкл крови; а – число эритроцитов, посчитанных в 80 малых квадратах камеры Горяева. Практически, после сокращений в формуле, количество посчитанных эритроцитов умножают на 10 000.
Метод подсчета количества эритроцитов в крови с помощью камеры Горяева
Состав крови образован плазмой и форменными компонентами, большую часть из которых составляют эритроциты. Зрелые кровяные клетки не содержат ядра и имеют двояковогнутую форму. Главная их функция – транспортировка газов в тканях органов. Уровень эритроцитарных клеток в крови человека зависим от таких факторов, как пол и возраст, но является величиной достаточно постоянной, поэтому колебание их количества дает ценную информацию в процессе диагностирования.
Для вычисления количества кровяных клеток чаще всего используется унифицированный метод подсчета эритроцитов с использованием оборудования, известного, как камера Горяева, либо с помощью электронных счетчиков автоматического типа. Оба способа на данный момент широко используются и в ежедневной лабораторной практике, и при научных изысканиях, так как погрешность результатов, полученных в ходе их применения, минимальна.
Строение камеры Горяева
Оптическое устройство – камера Горяева позволяет вычислить количество кровяных клеток в определенном объёме специальной жидкости. Идея создания устройства принадлежит русскому профессору Горяеву Н. К.
Главный элемент устройства – прозрачное предметное стекло с камерой, образованной углублением в форме прямоугольника, поверхность которой покрыта специальной микроскопической сеткой, и тонкое покровное стекло. Высокая точность результатов подсчета достигается благодаря повышенному объёму сетки в сравнении с аналогичными устройствами других типов.
Разбавление крови с целью исследования
Определение количества эритроцитов состоит из нескольких последовательных действий. Первым этапом становится разведение определенного объёма крови в реагенте. Делается это в связи с огромным числом форменных элементов.
В качестве реагента чаще всего выступает раствор хлорида натрия концентрацией 0,9%. При необходимости альтернативой служит 5% раствор натрия цитрата. Процедуру разбавления крови выполняют в пробирке или в специальном смесителе, называемом меланжером.
Внимание! Использование растворов с более высокой или низкой концентрацией исключено, так как повлечет за собой разрушение кровяных клеток.
Разбавление крови в меланжере
Меланжером называется изготовленный из стекла градуированный капилляр длинной 10 см с расширением на конце, внутри которого расположен шарик. Последний выполняет важную функцию – равномерное смешивание раствора и крови. Цвет шарика меланжерного капилляра будет красным, если он предназначен для эритроцитов, и белым – для работы с лейкоцитами.
Методика подсчета эритроцитов позволяет проводить процедуру исследования и со стабилизированной кровью, и с нестабилизированным материалом сразу после его забора у пациента.
Кровь набирают меланжерным капилляром до деления 0,5, после чего кончик смесителя очищают от крови с помощью марли либо ватки и следующим действием набирают разбавляющий раствор до деления 101. Перекрыв пальцами отверстия капилляра, полученный образец тщательно смешивают около 3 минут. В счётную камеру помещают четвёртую каплю, предварительно удалив первые три на марлю. Таким образом получают разбавление крови в 200 раз.
Разбавление крови в пробирке
При пробирочном методе разбавления крови исследуемый материал разводят в 200 раз следующим образом: 4 мл раствора хлорида натрия помещают в пробирку, после чего добавляют 0,02 мл крови.
Для этого забор материала производят пипеткой, кончик которой протирают ваткой или другой тканью. Образец крови помещают на дно пробирки, пипетку промывают ближе к поверхности раствором хлорида натрия. Готовый образец перемешивают и оставляют до дальнейшего этапа исследования, но менее чем на 3 часа.
Подсчет количества эритроцитов
Камера Горяева обязательно располагается горизонтально. Всю площадь сетки аккуратно заполняют разведенным образцом. Важно проследить, чтобы не образовались пузырьки воздуха, ведь их наличие значительно исказит результат. В таком положении камера остается в течение одной минуты с целью оседания кровяных клеток.
Унифицированный метод подсчета эритроцитов проходит при среднем увеличении посредством микроскопического осмотра. Подсчет числа эритроцитов в камере Горяева ведут в 5 больших квадратах, поделенных на 16 малых. Начало отсчета рекомендовано производить с большого квадрата, находящегося вверху слева, и далее по диагонали.
Важно! Чтобы количество клеток, находящихся на линиях малых квадратов, не было подсчитано дважды, рекомендуют пользоваться правилом Егорова: в каждом квадрате вести подсчет по двум определенным линиям (верхней и левой).
Начинают высчитывание клеток в малых квадратах в верхнем ряду слева направо от 1-го до 4-го в этом ряду. Переходя к следующему ряду, подсчет ведут в обратном порядке – справа налево. Переход к подсчету клеток в следующем большом квадрате производят после вычисления эритроцитов в этих 16 малых квадратах.
Непосредственно расчет числа эритроцитов ведут по формуле, отображенной на рисунке №2.
Формула расчета клеток
Обозначения в данной формуле расшифровываются следующим образом:
Внимание! Для достоверности результата расчет кровяных клеток при некоторых видах анемии необходимо проводить непосредственно после забора материала.
Возможные причины искажения результата
Как и любой другой лабораторный анализ, подсчет эритроцитов требует тщательной подготовки и аккуратности в исполнении. Искажение результатов анализа может возникнуть вследствие целого ряда причин. Оборудование хранят в сухом месте. Любая лабораторная работа, связанная с кровью, выполняется в резиновых перчатках.
Для начала следует убедиться в правильности подготовки и использования камеры. Перед работой и по ее окончании устройство необходимо тщательно промывать дистиллированной водой и насухо протирать мягкой тканью. Покровное стекло должно быть подготовлено заблаговременно таким же образом.
Возможные причины, влияющие на достоверность результата:
В последнее время все большую популярность получает метод подсчета эритроцитов с использованием электронных счетчиков автоматического типа. Такая тенденция вполне обоснованна, так как автоматизированный процесс исследования значительно точнее и менее трудоёмок.
Принцип действия данного оборудования основан на разном показателе электропроводности клеток крови и раствора, в котором они помещены. Специальное электромагнитное устройство регистрирует изменение уровня сопротивления электрической цепи, когда эритроциты движутся через отверстие капилляра. Уже через несколько секунд на цифровом табло высвечивается результат с высчитанным числом клеток.
Повышенный показатель красных кровяных клеток в анализе называется полицитемией. Данное состояние возникает вследствие патологий, характеризующихся потерей жидкости в организме, например при диарейном синдроме. Часто такое явление наблюдается на первых этапах инфекционных заболеваний, при отравлении токсичными веществами и прочем. Снижение же концентрации эритроцитов в крови известно как олигоцитемия. И зачастую такая патология проявляется во время различного вида анемии.
Работа № 1. Подсчет эритроцитов крови в камере Горяева.
Что такое камера Горяева, ее технические характеристики
Камера Горяева
Камера Горяева представляет из себя простое устройство для визуального подсчета форменных элементов крови под микроскопическим увеличением. Оно сконструировано на основе предметного стекла, имеющего специальные углубления для номинального объема крови, а также покровного стекла с нанесенной сеткой.
Различают несколько конструкций камеры Горяева в зависимости от количества камер (углублений для заполнения кровью), чаще всего в лабораториях применяются двухкамерные или четырехкамерные модели. Над каждой из камер находится специальная счетная сетка, нанесенная на покровное стекло методом лазерной гравировки либо при помощи микронапыления краски.
Приспособление сконструировано таким образом, что все имеющиеся камеры имеют равный объем, который указан в технической документации модели, их глубина и размеры секторов покровной сетки также стандартны. Это делает возможным переводить после подсчета форменных элементов их суммарные значения в единицы концентрации заданных клеток в объеме крови.
Методика подсчёта лейкоцитов в моче
В моче подсчитывается количество лейкоцитов в камере Горяева по Нечипоренко. Этот анализ нужен для мониторинга заболеваний почек. Периодическое исследование мочи помогает проследить за правильностью лечения и эффективностью назначенной терапии.
Сбор мочи
В изучение идёт только первая утренняя моча в середине мочеиспускания. Для пациента важно следовать основным правилам сбора этого биоматериала. Специальной дополнительной подготовки для исследования не требуется.
Описание сетки камеры Горяева
Сетка в камере Горяева
Покровное стекло имеет гравировку в виде сетки, большие квадраты которой имеют величину стороны в 1 мм. Чаще всего таких квадратов 9 над каждой счетной камерой, они расположены так, что образуют три столбца по три квадрата в каждом. Те большие квадраты, что располагаются по периферии, разделены на 16 квадратов поменьше, длина и ширина которых равны 0,2 мм. Стандартная глубина камеры под этими квадратами позволяет легко подсчитывать количество клеток в единицах объема, он равен для них 0,1 мм3 или 10-4 мл.
Большой квадрат, расположенный посередине, имеет дополнительные разделяющие линии, они нанесены так, что делят каждый из 16 средних квадратов еще на 16 самых маленьких. Их сторона равна 0,05 мм.
Норма лейкоцитов и отклонения
Норма лейкоцитов у людей составляет 4,0 – 9,0 × 10⁹/л. Или, по-другому, в 1 кубическом мм крови располагается примерно 6000 белых кровяных клеток.
На отклонения от нормы могут влиять внешние физиологические факторы:
Если количество белых кровяных клеток превышает 9,0 × 10⁹/л (повышены лейкоциты), такое состояние называется лейкоцитозом. Подобную картину можно увидеть при злокачественных заболеваниях крови, инфекциях, поражениях радиацией и отравлениях.
Лекарственные препараты тоже способны увеличить количество лейкоцитов. Некроз тканей, обильные кровотечения, в том числе в результате операций, почечная кома, болезни сердца – всё это может привести лейкоцитозу.
Падение количества лейкоцитов ниже 3,9 × 10⁹/л называется лейкопенией. Однако у некоторых людей фиксируется постоянное число лейкоцитов в количестве 3,5 × 10⁹/л. Принято считать, что у таких людей сохраняется резерв этих клеток в тканях в 50 раз больше, нежели в крови. Еще встречается функциональная лейкопения после введения анальгетиков, сульфаниламидов и других лекарственных препаратов, после долгой мышечной работы, в результате поражения инфекциями и вирусами (тиф, грипп, корь).
Правило Егорова для подсчета форменных элементов
Правильный подсчет клеток в сетке
Подсчет форменных элементов крови ведется под микроскопом с применением соответствующего увеличения, чаще всего используется окуляр х10. Подсчитывают число клеток в тех больших квадратах, что разделены на 16 средних, начинают считать от верхнего левого и двигаются вниз направо, захватывая при подсчете 5 больших квадратов.
Для того, чтобы верно определить количество клеток в заданном объеме крови, необходимо исключить повторный подсчет тех форменных элементов, что располагаются на границах или узлах сетки. Такая ошибка привела бы к увеличению подсчитываемого показателя, для ее устранения было сформулировано правило Егорова. Оно гласит, что к данному квадрату относятся те элементы, что лежат в его пределах, не касаясь нанесенных линий, а также те клетки, что располагаются на верхней и левой сторонах квадрата. Те клетки, что «касаются» нижней или правой стороны, при подсчете учитываться не должны.
Методика подсчета лейкоцитов
При ошибке анализатора помогает камера Горяева
Для подсчета лейкоцитов в крови в современных клинических лабораториях чаще всего используются специальные автоматические анализаторы, методика подсчета при помощи камеры Горяева относится к редко применяемым из-за своей трудоемкости и низкой скорости анализа. Для того, чтобы верно определить концентрацию отдельных видов лейкоцитов, требуется врач лабораторной диагностики или фельдшер-лаборант, владеющий навыками работы с микроскопом.
Подсчет при помощи камеры Горяева оправдан в тех случаях, когда автоматический анализатор не способен верно идентифицировать клетки крови пациента. Это случается при онкологических заболеваниях системы крови и некоторых других болезнях, при которых клетки имеют нетипичный вид и объем. К плюсам визуального подсчета относится возможность углубленной диагностики благодаря тому, что опытный врач способен отличить измененные клетки, характерные для отдельных патологий, и отразить их наличие в результатах анализа.
Лейкоциты должны быть подготовленными перед работой
Для подсчета отдельных видов лейкоцитов кровь разводят в несколько раз слабым раствором уксусной кислоты, при этом образцы без лейкоцитоза, как правило, следует разводить не менее чем в 20 раз, в случаях выраженного увеличения количества белых кровяных телец может потребоваться большее разведение. Для контрастирования изображения применяют окрашивание метиленовой синью.
После заполнения камер исследуемым объемом крови сверху накладывается покровное стекло сеткой и производится ее притирка, в ходе которой должны полностью исчезнуть пузыри воздуха между двумя стеклами. Заполненная камера помещается под микроскоп, причем целесообразно оставить ее неподвижной на 1-2 минуты для того, чтобы форменные элементы полностью прекратили движение и осели.
После этого на среднем увеличении (окуляр не менее чем х10) проводится подсчет отдельных видов лейкоцитов в не менее чем 100 квадратах. Для перевода получившегося числа в объемные значения необходимо умножить его на разведение (как правило, в 20 раз) и на количество квадратов, участвовавших в подсчете (чаще всего 100). Полученное число дает представление о количестве лейкоцитов в 1 мкл крови.
Определение лейкоцитов в крови
Методика подсчёта лейкоцитов
Подсчёт количества лейкоцитов начинается с разведения крови в 3-5% растворе этановой кислоты с метиловой синью в 20 раз. Рабочий материал перед применением протирают марлей насухо.
Покровное стекло нужно протереть до возникновения цветных колец Ньютона. Далее, камеру заполняют разведённой кровью, при этом первые две капли выпускают на фильтровальную бумагу. Жидкость попадает в камеру благодаря капиллярному свойству воды. Важно проследить, чтобы в желобки при заполнении ничего не затекало. Если это произошло, жидкость аккуратно убирают фильтровальной бумагой. Затем оставляют сетку в покое на минуту, ожидая, пока ФЭ остановят своё движение.
Подсчёт лейкоцитов осуществляется в пределах ста больших квадратов при малом увеличении, то есть при окуляре 10х и объективе 8х, по правилу Егорова. Полученная цифра используется в формуле.
Х = (n
× 250 × 20) / 100 или Х = n × 50
Х – количество лейкоцитов.
n – число, полученное в результате подсчёта в камере.
Количество лейкоцитов определяют, принимая во внимание число больших квадратов сетки – 100 и разведение крови – 20.
Как происходит подсчет лейкоцитов
Методика подсчета эритроцитов
Соблюдение алгоритма позволяет произвести точный подсчет клеток
Исследуемую кровь разводят при помощи физиологического раствора минимум в 100 раз для того, чтобы стал возможен визуальный подсчет красных кровяных телец. При недостаточном разведении в камерах образуется двойной слой форменных элементов крови, что делает невозможным их определение. После наложения покровного стекла и притирки проводят микроскопирование препарата при увеличении окуляром х10. Подсчет ведется во всех 5 больших квадратах, разделенных линиями на 16 секторов. Расчет объемных значений проводят при помощи умножения полученного числа эритроцитов на степень разведения (чаще в 100 или 200 раз) и на 4000, затем проводят деление полученного числа на 80 (количество малых квадратов при подсчете). Полученное число характеризует количество эритроцитов в 1 мкл крови.
Алгоритмы подсчета эритроцитов в камере Горяева
Получают капиллярную кровь с помощью прокола скарификатором подушечки пальца. Важно, чтобы первая капля не попала в капилляр, так как в ней содержится тканевая жидкость и поврежденные эритроциты. Собирают кровь в капилляр.
Далее проводят манипуляция для проведения исследования с помощью камеры Горяева.
Метод является достаточно информативным, но возможны погрешности. Врач может ошибиться в подсчетах с помощью микроскопа, или взять объём жидкости, в котором находится недостаточно эритроцитов. Поэтому при появлении погрешностей или не точных результатов терапевт может назначить повторные исследования на полуавтоматическом анализаторе, который подсчитывает точное количество форменных элементов в 1 мл жидкости.
Достоинством метода является то, что врач может обнаружить другие образования помимо эритроцитов, что поможет выявить нарушения в организме.
Формула подсчета количества эритроцитов в камере Горяева
После получения количества красных кровяных телец, число необходимо подставить в формулу. С ее помощью подсчитывается число красных кровяных телец на заданный объем биологической жидкости.
Чтобы пересчитать эритроциты на 1 л крови, полученный результат умножают на 1012.
Норма эритроцитов и отклонения
В норме количество эритроцитов отличается по полу и возрасту двоеточие
Количество эритроцитов может быть повышено или снижено. Существуют физиологические причины изменения. Например, у женщины во время менструации количество эритроцитов снижено, так как теряется некоторый объём биологической жидкости.
Патологические причины повышения эритроцитов:
Патологические причины снижения эритроцитов:
С помощью камеры Горяева подсчитывают число эритроцитов. Важно знать, что бывают более информативные методы исследования, которые позволяют исключить риск врачебной ошибки. Приспособление работает точно, если соблюдаются методы его дезинфекции, врач тщательно пересчитывает все клетки. После получения результата анализов необходимо обратиться к врачу, самостоятельно поставить диагноз невозможно.
Читайте подробный обзор всех методик подсчета количества эритроцитов от врача.
Подсчет лейкоцитов в камере Горяева — устройство камеры и принцип подсчета показателей
Что такое камера Горяева, ее технические характеристики
Камера Горяева
Камера Горяева представляет из себя простое устройство для визуального подсчета форменных элементов крови под микроскопическим увеличением. Оно сконструировано на основе предметного стекла, имеющего специальные углубления для номинального объема крови, а также покровного стекла с нанесенной сеткой.
Различают несколько конструкций камеры Горяева в зависимости от количества камер (углублений для заполнения кровью), чаще всего в лабораториях применяются двухкамерные или четырехкамерные модели. Над каждой из камер находится специальная счетная сетка, нанесенная на покровное стекло методом лазерной гравировки либо при помощи микронапыления краски.
Приспособление сконструировано таким образом, что все имеющиеся камеры имеют равный объем, который указан в технической документации модели, их глубина и размеры секторов покровной сетки также стандартны. Это делает возможным переводить после подсчета форменных элементов их суммарные значения в единицы концентрации заданных клеток в объеме крови.
Изучение счетной камеры Горяева и заполнение ее кровью для подсчета эритроцитов и лейкоцитов
Количество эритроцитов и лейкоцитов подсчитывают в специальных счетных камерах. Для этой цели пользуются счетной камерой Горяева, которая представляет собой стекло с нанесенными на него двумя сетками. Сетки отделены одна от другой углублениями и делятся разграничительными линиями на 225 квадратов. Площадь сетки 9 мм2, высота, создающаяся при притирании шлифованного покровного стекла в камере, 0,1 мм, объем 0,9 мм3. Перед заполнением камеры кровью ее моют водой и насухо вытирают.
К сухой поверхности камеры притирают шлифованное покровное стекло, плавно продвигая его по ней взад и вперед до появления цветных колец Ньютона в местах соприкосновения покровного стекла со стеклом камеры. Затем кровь в смесителе встряхивают в течение 1-2 минут, после чего из смесителя выпускают на ватку 1-2 капли крови, следующую каплю помещают перед шлифованным покровным стеклом. При нанесении капли крови надо следить за тем, чтобы в пространство над сеткой камеры не попал воздух и чтобы не было избытка жидкости. Одну сетку заполняют для подсчета эритроцитов, вторую — для подсчета лейкоцитов.
Для заполнения камеры Горяева кровью, взятой по способу Н. М. Николаева (пробирочный метод), поступают следующим образом. К счетной камере притирают шлифованное стекло. Из каждой пробирки, предварительно встряхнув ее, с помощью стеклянной палочки с оплавленным концом берут по одной капле жидкости и заполняют ими раздельно обе сетки камеры, для чего каплю помещают перед щелью, образующейся между шлифованным стеклом и счетной камерой, в результате чего жидкость заполняет пространство над сетками.
Описание сетки камеры Горяева
Сетка в камере Горяева
Покровное стекло имеет гравировку в виде сетки, большие квадраты которой имеют величину стороны в 1 мм. Чаще всего таких квадратов 9 над каждой счетной камерой, они расположены так, что образуют три столбца по три квадрата в каждом. Те большие квадраты, что располагаются по периферии, разделены на 16 квадратов поменьше, длина и ширина которых равны 0,2 мм. Стандартная глубина камеры под этими квадратами позволяет легко подсчитывать количество клеток в единицах объема, он равен для них 0,1 мм3 или 10-4 мл.
Большой квадрат, расположенный посередине, имеет дополнительные разделяющие линии, они нанесены так, что делят каждый из 16 средних квадратов еще на 16 самых маленьких. Их сторона равна 0,05 мм.
Подсчёт эритроцитов и лейкоцитов в счетной камере Горяева
Количество эритроцитов и лейкоцитов в камере Горяева подсчитывают с помощью микроскопа. Для этого заполненную разведенной кровью камеру Горяева помещают на предметный столик микроскопа и под малым увеличением (окуляр 15 X или 10Х, объектив 8Х), с опущенным конденсором находят сетку камеры. К подсчету форменных элементов приступают через 2-3 минуты после заполнения камеры кровью.
Эритроциты подсчитывают в пяти квадратах, каждый из которых разделен на 16 маленьких квадратиков. Подсчет начинают с левого верхнего квадрата, а затем продвигают камеру по диагонали сверху вниз. Во избежание повторного подсчета одних и тех же эритроцитов руководствуются следующим правилом: все эритроциты внутри квадратика и на разграничительных линиях подсчитывают только тогда, когда они большей своей половиной заходят внутрь квадратика; клетки, пересеченные разграничительной чертой пополам, подсчитывают лишь на двух сторонах из четырех сторон квадрата (на левой и верхней); клетки, выходящие большей своей половиной за пределы разграничительных линий, совсем не считают. Результаты подсчета эритроцитов по каждому из пяти больших квадратов записывают и суммируют. Для расчета количества эритроцитов пользуются следующей формулой:
где х — количество эритроцитов в 1 мм3 крови; а — сумма эритроцитов, подсчитанных в пяти квадратах; б — разведение крови в 200 раз; в — количество сосчитанных маленьких квадратиков — 80.
Для упрощения расчета к количеству подсчитанных эритроцитов приписывают четыре нуля. В норме количество эритроцитов от 4 500 000 до 5 000 000 в 1 мм3 крови.
Лейкоциты подсчитывают в 100 больших квадратах. При подсчете их руководствуются теми же правилами, которые указаны для эритроцитов, а затем производят расчет по приведенной выше формуле, в которой цифра разведения равна 20, а количество подсчитанных квадратов — 1600. Для простоты расчета количество подсчитанных лейкоцитов умножают на 50 или делят на 2 и приписывают два пуля. В норме количество лейкоцитов от 5000 до 8000 в 1 мм3 крови.
После подсчета лейкоцитов смесители моют следующим образом: резиновой грушей удаляют остатки крови, после чего их многократно промывают дистиллированной водой, спиртом и просушивают эфиром или в сушильном шкафу. Показателем чистоты смесителей служит свободное передвижение бусинки при встряхивании смесителя.
В последнее время для подсчета эритроцитов и лейкоцитов пользуются целоскопом отечественного производства СФЭК-62, который позволяет быстро и точно определить количество форменных элементов в 1 мм3 крови. Техника его использования подробно изложена в инструкции, приложенной к прибору.
Правило Егорова для подсчета форменных элементов
Правильный подсчет клеток в сетке
Подсчет форменных элементов крови ведется под микроскопом с применением соответствующего увеличения, чаще всего используется окуляр х10. Подсчитывают число клеток в тех больших квадратах, что разделены на 16 средних, начинают считать от верхнего левого и двигаются вниз направо, захватывая при подсчете 5 больших квадратов.
Для того, чтобы верно определить количество клеток в заданном объеме крови, необходимо исключить повторный подсчет тех форменных элементов, что располагаются на границах или узлах сетки. Такая ошибка привела бы к увеличению подсчитываемого показателя, для ее устранения было сформулировано правило Егорова. Оно гласит, что к данному квадрату относятся те элементы, что лежат в его пределах, не касаясь нанесенных линий, а также те клетки, что располагаются на верхней и левой сторонах квадрата. Те клетки, что «касаются» нижней или правой стороны, при подсчете учитываться не должны.
Как правильно рассчитать количество кровяных клеток?
Подсчет эритроцитов в камере Горяева осуществляется в пяти больших квадратах, что равно восьмидесяти малым. Для того чтобы избежать ошибки из-за неравномерного распределения образцов крови, выбирают квадраты, расположенные по диагонали. Отдельное внимание обращают на клетки, расположенные по краям, — здесь считают эритроциты на левой и верхней стенках, но не берут во внимание те, которые расположены на нижней и правой линиях.
Для того чтобы определить количество эритроцитов в миллилитре крови, число клеток в пяти больших квадратах умножают на 20 000 (при разведении в 400 раз).
Лейкоциты в камере Горяева считают по-другому. Здесь нужно вычислить количество элементов по меньшей мере в сотне больших квадратов. Полученное количество делят на 1600, после чего умножают на 4000, а затем на 20 (степень разведения).
Для проведения данных исследований необходимо следующее оснащение рабочего места:
Методика подсчета лейкоцитов
При ошибке анализатора помогает камера Горяева
Для подсчета лейкоцитов в крови в современных клинических лабораториях чаще всего используются специальные автоматические анализаторы, методика подсчета при помощи камеры Горяева относится к редко применяемым из-за своей трудоемкости и низкой скорости анализа. Для того, чтобы верно определить концентрацию отдельных видов лейкоцитов, требуется врач лабораторной диагностики или фельдшер-лаборант, владеющий навыками работы с микроскопом.
Подсчет при помощи камеры Горяева оправдан в тех случаях, когда автоматический анализатор не способен верно идентифицировать клетки крови пациента. Это случается при онкологических заболеваниях системы крови и некоторых других болезнях, при которых клетки имеют нетипичный вид и объем. К плюсам визуального подсчета относится возможность углубленной диагностики благодаря тому, что опытный врач способен отличить измененные клетки, характерные для отдельных патологий, и отразить их наличие в результатах анализа.
Лейкоциты должны быть подготовленными перед работой
Для подсчета отдельных видов лейкоцитов кровь разводят в несколько раз слабым раствором уксусной кислоты, при этом образцы без лейкоцитоза, как правило, следует разводить не менее чем в 20 раз, в случаях выраженного увеличения количества белых кровяных телец может потребоваться большее разведение. Для контрастирования изображения применяют окрашивание метиленовой синью.
После заполнения камер исследуемым объемом крови сверху накладывается покровное стекло сеткой и производится ее притирка, в ходе которой должны полностью исчезнуть пузыри воздуха между двумя стеклами. Заполненная камера помещается под микроскоп, причем целесообразно оставить ее неподвижной на 1-2 минуты для того, чтобы форменные элементы полностью прекратили движение и осели.
После этого на среднем увеличении (окуляр не менее чем х10) проводится подсчет отдельных видов лейкоцитов в не менее чем 100 квадратах. Для перевода получившегося числа в объемные значения необходимо умножить его на разведение (как правило, в 20 раз) и на количество квадратов, участвовавших в подсчете (чаще всего 100). Полученное число дает представление о количестве лейкоцитов в 1 мкл крови.
Определение содержания гемоглобина в одном эритроците (СГЭ)
В последнее время наряду с цветным показателем рассчитывают более достоверную абсолютную величину — содержание гемоглобина в одном эритроците — СГЭ. При расчете этого показателя весовое количество гемоглобина выражают в очень мелких единицах — микромикрограммах (мкмкг), или, что правильнее — пикограммах (пг). СГЭ получают умножением количества гемоглобина в грамм-процентах на 10 и делением на число эритроцитов в миллионах.
Лабораторная камера Горяева
, названная в честь русского врача, профессора Казанского университета Горяева Н.К., является специальным монолитным предметным стеклом, предназначенным для подсчета количества клеток в заданном объеме жидкости. Кроме того, используя камеру Горяева можно определить увеличение микроскопа. Камеры Горяева широко применяются в области клинических и биомедицинских исследований.
Популярные области применение камеры Горяева:
Камеры Горяева выпускаются в двух модификациях: двухсеточные (двухкамерные) и четырехсеточные (четырехкамерные). В определении цены камеры Горяева важную роль играет качество шлифовки стекла, метод нанесения сетки – лазерная гравировка или же вакуумное напыление.
Что собой представляет камера Горяева?
Камера Горяева есть не что иное, как прозрачное монолитное предметное стекло поперечными прорезями и нанесенной специальным образом микроскопической сеткой. В случае двухкамерной камеры Горяева мы имеем четыре прорези, образующие три поперечно расположенных площадки, при этом средняя площадка разделена продольной прорезью на две одинаковых камеры, на каждой из поверхности площадки которых нанесена сетка. В случае же четырехкамерной камеры Горяева мы получаем предметное стекло с пятью прорезями, образующих четыре площадки, при этом две внутренние дополнительно разделены продольной прорезью для получения четырех камер с нанесенной микроскопической сеткой на поверхности площадок.
Рассмотрим более подробно особенности сетки
. Специальная сетка наносится на внутренние площадки, расположенные ниже соседних боковых площадок на 0.1мм. Боковые площадки предназначены для притирания покровного стекла до появления Ньютоновских колец. Как правило, используют специальное покровное стекло для камеры Горяева с закругленными краями. После притирания покровного стекла создается камера, закрытая с двух боковых сторон, а с двух других остаются щели (так называемые, капиллярные пространства), через которые и заполняют камеру. Что конкретно представляет собой сетка? Микроскопическая сетка камеры Горяева расчерчена на большие и маленькие квадраты, сгруппированные различными способами. Сетка Горяева содержит 225 больших квадратов (15 рядов по 15 больших квадратов в каждом), разграфленных вертикально, горизонтально, крест-накрест и неразграфленных. При этом размеры малых делений клетки сетки составляют 0.05мм, а больших – 0.2мм. Важно, что малый квадрат со стороной 0.05мм во всех сетках является постоянной величиной. Не трудно рассчитать, что площадь малого квадрата равна 0.0025 мм2, а большого квадрата – 0.04мм2. Тогда получаем, что объем жидкости над квадратом, образованным большими делениями сетки Горяева, составляет 0.004 микролитра.
Подсчитав количество форменных элементов (ФЭ) над большим квадратом, можно подсчитать плотность данного типа клеток в суспензии по формуле:
X — количество ФЭ/мл, M- количество ФЭ над большим квадратом.
При работе с камерой Горяева важно следить, чтобы ее рабочие поверхности оставались сухими и чистыми. Кроме того, при подсчете форменных элементов нельзя допускать наличие воздушных пузырей на сетке камеры, так как они могут мешать точности подсчета.
После работы с камерами Горяева следует выполнить их дезинфекцию одним из допустимых способов:
Приведем примеры применения камеры Горяева и некоторые формулы.
Методика подсчета эритроцитов
Соблюдение алгоритма позволяет произвести точный подсчет клеток
Исследуемую кровь разводят при помощи физиологического раствора минимум в 100 раз для того, чтобы стал возможен визуальный подсчет красных кровяных телец. При недостаточном разведении в камерах образуется двойной слой форменных элементов крови, что делает невозможным их определение. После наложения покровного стекла и притирки проводят микроскопирование препарата при увеличении окуляром х10. Подсчет ведется во всех 5 больших квадратах, разделенных линиями на 16 секторов. Расчет объемных значений проводят при помощи умножения полученного числа эритроцитов на степень разведения (чаще в 100 или 200 раз) и на 4000, затем проводят деление полученного числа на 80 (количество малых квадратов при подсчете). Полученное число характеризует количество эритроцитов в 1 мкл крови.
Алгоритмы подсчета эритроцитов в камере Горяева
Получают капиллярную кровь с помощью прокола скарификатором подушечки пальца. Важно, чтобы первая капля не попала в капилляр, так как в ней содержится тканевая жидкость и поврежденные эритроциты. Собирают кровь в капилляр.
Далее проводят манипуляция для проведения исследования с помощью камеры Горяева.
Метод является достаточно информативным, но возможны погрешности. Врач может ошибиться в подсчетах с помощью микроскопа, или взять объём жидкости, в котором находится недостаточно эритроцитов. Поэтому при появлении погрешностей или не точных результатов терапевт может назначить повторные исследования на полуавтоматическом анализаторе, который подсчитывает точное количество форменных элементов в 1 мл жидкости.
Достоинством метода является то, что врач может обнаружить другие образования помимо эритроцитов, что поможет выявить нарушения в организме.
Норма лейкоцитов и отклонения
Норма лейкоцитов у людей составляет 4,0 – 9,0 × 10⁹/л. Или, по-другому, в 1 кубическом мм крови располагается примерно 6000 белых кровяных клеток.
На отклонения от нормы могут влиять внешние физиологические факторы:
Если количество белых кровяных клеток превышает 9,0 × 10⁹/л (повышены лейкоциты), такое состояние называется лейкоцитозом. Подобную картину можно увидеть при злокачественных заболеваниях крови, инфекциях, поражениях радиацией и отравлениях.
Лекарственные препараты тоже способны увеличить количество лейкоцитов. Некроз тканей, обильные кровотечения, в том числе в результате операций, почечная кома, болезни сердца – всё это может привести лейкоцитозу.
Падение количества лейкоцитов ниже 3,9 × 10⁹/л называется лейкопенией. Однако у некоторых людей фиксируется постоянное число лейкоцитов в количестве 3,5 × 10⁹/л. Принято считать, что у таких людей сохраняется резерв этих клеток в тканях в 50 раз больше, нежели в крови. Еще встречается функциональная лейкопения после введения анальгетиков, сульфаниламидов и других лекарственных препаратов, после долгой мышечной работы, в результате поражения инфекциями и вирусами (тиф, грипп, корь).
Определение лейкоцитов в крови
Методика подсчёта лейкоцитов
Подсчёт количества лейкоцитов начинается с разведения крови в 3-5% растворе этановой кислоты с метиловой синью в 20 раз. Рабочий материал перед применением протирают марлей насухо.
Покровное стекло нужно протереть до возникновения цветных колец Ньютона. Далее, камеру заполняют разведённой кровью, при этом первые две капли выпускают на фильтровальную бумагу. Жидкость попадает в камеру благодаря капиллярному свойству воды. Важно проследить, чтобы в желобки при заполнении ничего не затекало. Если это произошло, жидкость аккуратно убирают фильтровальной бумагой. Затем оставляют сетку в покое на минуту, ожидая, пока ФЭ остановят своё движение.
Подсчёт лейкоцитов осуществляется в пределах ста больших квадратов при малом увеличении, то есть при окуляре 10х и объективе 8х, по правилу Егорова. Полученная цифра используется в формуле.
Х = (n × 250 × 20) / 100 или Х = n × 50
Х – количество лейкоцитов.
n – число, полученное в результате подсчёта в камере.
Количество лейкоцитов определяют, принимая во внимание число больших квадратов сетки – 100 и разведение крови – 20.
Как происходит подсчет лейкоцитов