Аликвотирование биоматериала что это

Аликвота

Аликвота (лат. aliquoties, «несколько раз; несколько частей»)

В математике

Аликвота целого числа — любой из его делителей, кроме самого числа. Например, 2 является аликвотой 12. Сумма всех аликвот даёт n:

где σ(n) — сумма делителей числа.

Натуральное число, меньшее данного натурального и не являющееся его делителем, называется аликвантой.

В аналитической химии

В аналитической химии — точно измеренная кратная часть образца (объём раствора), взятая для анализа, которая сохраняет свойства основного образца.

В фармацевтике аликвотой часто называют метод измерения концентрации вещества, количество которого меньше, чем порог чувствительности используемой шкалы. Например, если шкала надежна только для образцов массой свыше 120 мг, но нужно отмерить 40 мг лекарства, требуется аликвота. Для этого приготовляется раствор нужной концентрации, например, 120 мг лекарства смешивается с пропорциональным количеством растворителя, а потом взвешивается то количество раствора, которое содержит 40 мг лекарства.

Для отбора аликвот используют мерную посуду, чаще всего пипетки.

Полезное

Смотреть что такое «Аликвота» в других словарях:

аликвота — Определенный объем жидкого, газообразного или сыпучего гомогенного вещества, представляющий собой часть целого. [ГОСТ Р 52361 2005] аликвота Часть целого, которую требуется проанализировать. Примечание. При анализе аликвоты, т. е. гомогенной… … Справочник технического переводчика

аликвота — небольшое количество вещества в растворе точно известного объема. (Источник: «Микробиология: словарь терминов», Фирсов Н.Н., М: Дрофа, 2006 г.) … Словарь микробиологии

аликвота — сущ., кол во синонимов: 2 • фракция (9) • часть (105) Словарь синонимов ASIS. В.Н. Тришин. 2013 … Словарь синонимов

Аликвота — * аліквота * aliquot 1. Любая часть или фракция от целого. 2. Проба, содержащаяся в чем то кратное число раз. 3. Небольшое количество вещества в растворе точно известного объема … Генетика. Энциклопедический словарь

аликвота — aliquot аликвота. Проба, содержащаяся в чем то кратное число раз. (Источник: «Англо русский толковый словарь генетических терминов». Арефьев В.А., Лисовенко Л.А., Москва: Изд во ВНИРО, 1995 г.) … Молекулярная биология и генетика. Толковый словарь.

аликвота — 14 аликвота: Определенный объем жидкого, газообразного или сыпучего гомогенного вещества, представляющий собой часть целого. Источник: ГОСТ Р 52361 2005: Контроль объекта аналитический. Термины и определения оригинал документа … Словарь-справочник терминов нормативно-технической документации

аликвота — (лат aluquotes неколкупати) мат за број што е содржан во друг број без остаток (на пр, 2, 3 и 6 се аликвоти на бројот 12) … Macedonian dictionary

ГОСТ Р 52361-2005: Контроль объекта аналитический. Термины и определения — Терминология ГОСТ Р 52361 2005: Контроль объекта аналитический. Термины и определения оригинал документа: 49 аккредитованная аналитическая лаборатория: Аналитическая лаборатория, получившая в результате ее проверки органом по аккредитации… … Словарь-справочник терминов нормативно-технической документации

Аллиони, Карло — В Википедии есть статьи о других людях с такой фамилией, см. Аллиони. Аллиони, Карло итал. Carlo Allioni … Википедия

Аллиони — Аллиони, Карло В Википедии есть статьи о других людях с фамилией Аллиони. Аллиони, Карло итал. Carlo Allioni … Википедия

Источник

Аликвотирование биоматериала что это

В последние годы все больше публикаций посвящено анализу качества научных работ, в частности проблеме низкой воспроизводимости результатов исследований [1]. В связи с этим актуальны усилия, направленные на повышение стандартизации преаналитического этапа научных исследований, а также подробное описание всех деталей этого этапа.

Значение контроля качества образцов

Контроль качества (КК) биообразцов, применяемых для научных исследований, имеет принципиально важное значение для обеспечения достоверности получаемых данных. Однородность процедур сбора, транспортировки и условий хранения биообразцов имеет решающее значение для обеспечения качества многоцентровых научных исследований.

Важным и эффективным инструментом для такой стандартизации и сохранения большого количества биологических образцов является создание биобанка. Биобанк — структура для сбора, хранения и поставки биологических образцов и связанных с ними данных, которая следует стандартным операционным процедурам и предоставляет материалы для научного использования [2].

Все биообразцы подвергаются процедурам сбора, транспортировки, пробоподготовки и хранения. Процедуры в биобанке выполняются строго по принятым стандартам, в противном случае может снизиться качество биообразцов. Забор биоматериала осуществляется медицинским персоналом по стандартной методике в соответствии с п. 3.2 ГОСТ 53079.4 — 2008 [3]. Далее биоматериал вместе с необходимыми документами транспортируется в биобанк, где осуществляется пробоподготовка и регистрация полученного биоматериала (рис. 1). Рис. 1. «Жизненный цикл» биообразцов.

Таблица 1. Диагностические инструменты КК

Таблица 2. Пригодность биологического материала для исследований в различных областях

Пробоподготовка крови включает центрифугирование и дальнейшее аликвотирование сыворотки или плазмы крови. В соответствии со стандартом необходимо выполнить центрифугирование крови не позднее, чем через 1 ч после забора. Затем аликвотированный биоматериал помещается на хранение в морозильные камеры при температуре –80 °С.

Процедуры КК предназначены для оценки данных и биообразцов, используемых в научных исследованиях. КК данных включает контроль демографической, клинической информации, точность обработки данных, в то время как КК биологических образцов включает анализы на подлинность, целостность и идентичность образцов [1]. КК биологических образцов необходим для обеспечения точной характеристики и категоризации образцов, а также для избежания ошибок в последующих исследованиях из-за внутренней неоднородности в образцах.

Процедуры КК могут осуществляться биобанком, конечным пользователем или лабораторией субподрядчиков и должны выполняться с соблюдением правил GLP (Good Laboratory Practice, Надлежащая лабораторная практика) или стандартов ISO 15189:2012 (Медицинские лаборатории — особые требования к качеству и компетентности), ISO 17025:2005 или CLIA (Clinical laboratory improvement amendments, Поправки к клиническим лабораторным улучшениям) [4—6].

Ретроспективный КК может быть применен либо к случайно выбранным образцам, либо к образцам, качество которых вызывает наибольшее сомнение. Первый подход позволяет сравнивать различные места сбора, а второй позволяет целенаправленно оценивать образцы с «наибольшим риском» [2].

Инструменты контроля качества биологических образцов

Контроль качества биологических образцов является важным элементом в научных исследованиях. В настоящее время отсутствует консенсус относительно оптимальных инструментов КК образцов (маркеры и анализы). Инструменты К.К. можно разделить на два типа: диагностические и прогностические [7].

Диагностические инструменты оценивают этапы обработки биологического образца (задержка обработки образца, время или тип фиксации, продолжительность хранения) [7]. Прогностические инструменты оценивают выполнимость и/или надежность последующего анализа на данных образцах. Это особенно важно для методов с высокой пропускной способностью, поскольку прогностические инструменты предсказывают успешную производительность метода (рис. 2) Рис. 2. Инструменты контроля качества биообразцов. [7].

Наиболее легко применимыми инструментами являются маркеры с известным порогом для преаналитического отклонения и известным эталонным диапазоном для аналита К.К. Было выявлено лишь несколько значимых маркеров, соответствующих этим критериям: CD40L (маркер воспаления) для оценки качества сыворотки при повышенных температурах и VEGF (фактор роста эндотелия сосудов) для оценки замораживания–оттаивания сыворотки [1]. Для полной оценки качества биообразца необходимо использовать несколько маркеров КК. В статье представлены наиболее перспективные инструменты КК биологических образцов, которые были определены группой экспертов международного сообщества ISBER (International society for biological and environmental repositories) [7, 9].

Одной из задач биобанкирования является предоставление гарантии того, что образец действительно соответствует требуемым параметрам. Например, когда биобанк предоставляет биообразцы для исследований от пациентов с какими-либо заболеваниями, необходимо точно знать, возможно ли провести исследования на выявление того или иного маркера, который соответствует данному заболеванию.

Соблюдение температурных и временныˊх рамок на этапе прецентрифугирования, центрифугирования и хранения очень важно. В противном случае некоторые маркеры могут деградировать, и данные образцы станут непригодными для ряда ценных исследований. В связи с этим важны как процедуры строгой документации всего «жизненного цикла биообразца», так и процедуры КК, которые позволяют определить временныˊе характеристики этапов пробоподготовки в случае необходимости. Кроме того, при использовании биоматериала для изучения определенных заболеваний возможна оценка ряда параметров, показывающих пригодность конкретных биообразцов для исследований в данной сфере.

Далее в статье будут приведены основные известные на данный момент процедуры определения качества биообразцов сыворотки и плазмы, в том числе их пригодность для исследований в различных научно-медицинских сферах.

Сыворотка крови

Контроль качества образцов сыворотки крови по параметру времени перед центрифугированием

Рецептор трансферрина. R. De Jongh и соавт. [8, 9] показали увеличение концентрации растворимого рецептора трансферрина, измеренного методом иммуноферментного анализа (ИФА), на 90% после 8-часовой задержки прецентрифугирования, и сообщили о рефе-рентном диапазоне от 171 до 212 Ед/мл.

Аскорбиновая кислота. A. Karlsen и соавт. [10] предложили измерять показатель аскорбиновой кислоты в качестве потенциального инструмента КК сыворотки и плазмы методом хроматографии. Показано 70% снижение уровня аскорбиновой кислоты после 6-часовой задержки прецентрифугирования крови при комнатной температуре, а также 100% снижение после 3 мес хранения при –20 °С. Из клинической химии известно, что референсный диапазон составляет от 26 до 85 мкмоль/л [11].

Также можно проверить условия предварительного центрифугирования и убедиться, что образец пригоден для анализа путем измерения уровня белка IL8. Уровень IL8 выше 125 пг/мл или выше 528 пг/мл указывает на задержку перед центрифугированием при комнатной температуре, превышающей 24 ч или 48 ч соответственно [9, 14].

Контроль качества образцов сыворотки крови по параметру времени после центрифугирования. Можно проверить условия после центрифугирования и убедиться, что образец пригоден для протеомного анализа, измерив концентрацию sCD40L с помощью ИФА. Если концентрация sCD40L ниже 4720 пг/мл, то образец после центрифугирования выдерживали при комнатной температуре в течение 24 ч и более; если ниже 1693 пг/мл — в течение 48 ч и более [9].

Условия хранения. VEGF. K. Kisand и соавт. [15] недавно показали, что VEGF в сыворотке является лабильным к размораживанию—оттаиванию и длительности хранения либо при –20 °C, либо при –80 °C. При измерении VEGF с помощью ELISA после 1—6 циклов замораживания—оттаивания маркер переставал обнаруживаться. Тесты ускоренного старения и графики Аррениуса позволяют провести экстраполяцию для предсказания того, что VEGF не будет обнаружен после 11 мес хранения при –20 °C или после 4,5 года хранения при –80 °C. Контрольный диапазон VEGF, сообщаемый производителями наборов для ИФА (например «R & D Systems, Inc.», вкладыш в упаковку: Иммуноанализ Quantikine Human Total MMP7; Миннеаполис, Миннесота), составляет от 62 до 707 пг/мл в сыворотке. Однако эти результаты не были подтверждены на плазме [16].

Плазма крови ЭДТА

Контроль качества образцов плазмы крови ЭДТА по параметру времени до центрифугирования

GM-CSF, IL-1α и G-CSF. S. Ayache и соавт. [17] выполнили ИФА для изучения общего профиля хемокинов и цитокинов в плазме ЭДТА, собранной с ингибиторами протеазы или без них. Двухчасовая задержка прецентрифугирования при комнатной температуре вызвала 11–20-кратное увеличение GM-CSF, IL-1α и G-CSF в крови, собранной без ингибиторов протеазы, и 7–10-кратное увеличение тех же белков в крови, собранной с ингибиторами протеазы. Базовые контрольные уровни были зарегистрированы как 214±163 пг/мл для GM-CSF, 9,4±7,7 пг/мл для IL-1α и 119±60 пг/мл для G-CSF.

Можно проверить условия предварительного центрифугирования и убедиться, что образец пригоден для целей метаболического анализа:

а) используя ферментативный анализ LacaScore, если LacaScore ниже 5, то образец выдерживали при комнатной температуре менее 3 ч;

б) с использованием метода METANOMICS GC-MS, если показатель MxP равен или превышает 90, то образец выдерживали при комнатной температуре менее 2 ч; если в диапазоне 89—70, то в течение 2—6 ч; если ниже 70, то образец хранился при комнатной температуре более 6 ч [9].

Также можно проверить задержку перед центрифугированием и убедиться, что образец пригоден для протеомного, метаболического анализа, анализа cfDNA или ccfRNA, путем измерения концентрации IL16 с помощью ELISA. Если концентрация IL16 выше чем 313 пг/мл или выше чем 897 пг/мл, время задержки перед центрифугированием при комнатной температуре было больше чем 24 или 48 ч соответственно [9, 14].

Аскорбиновая кислота. Одним из методов проверки времени задержки перед центрифугированием является измерение аскорбиновой кислоты методом хроматографии, также как в случае сыворотки крови (см. раздел 2.1.1.).

Контроль качества образцов плазмы крови ЭДТА по параметру времени после центрифугирования. Можно проверить условия после центрифугирования и убедиться, что образец пригоден для протеомного анализа:

а) путем измерения концентрации sCD40L с помощью ИФА — если концентрация ниже 185 пг/мл, пробу выдерживали при комнатной температуре более 48 ч;

б) измерение пептида компонента 3 комплемента (C3f) и компонента 4 комплемента (C4) с использованием MALDI-TOF-MS или LC-ESI-MS; если возможно обнаружить пик для C4 при 1896,1 m/z и пик для C3f при 2021,1 m/z, образец выдерживали при комнатной температуре более 4 ч [9].

Витамин Е. M. Ockè и соавт. [18] сообщили, что содержание витамина Е в плазме ЭДТА уменьшилось более чем на 90%, когда плазма хранилась более 24 мес при –20 °C. Аналитическим методом была высокоэффективная жидкостная хроматография. Референсный диапазон составляет от 19 до 31 мкмоль/л.

Цитратная плазма

Контроль качества образцов цитратной плазмы по параметру времени перед центрифугированием. Можно проверить время до этапа центрифугирования и убедиться, что образец пригоден для анализа белков, путем измерения активности фактора VIII (фактор свертывания крови): активность белка С с использованием анализа активности коагуляции. Если активность ниже 50 МЕ/дл, образец выдерживали при 4 °C более 24 ч [9].

Также можно проверить задержки перед центрифугированием и убедиться, что образец пригоден для протеомного анализа, измеряя концентрацию интерлейкина-8 (ИЛ-8) с помощью ИФА. Если концентрация ИЛ-8 превышает 21,5 пг/мл, время предварительного центрифугирования при комнатной температуре превышает 48 ч [9].

Контроль качества образцов цитратной плазмы по параметру времени после центрифугирования. Можно проверить время, прошедшее после центрифугирования до замораживания, и убедиться, что образец пригоден для протеомного анализа следующим методом: измерение пептида компонента 3 комплемента (C3f) и компонента 4 комплемента (C4) с использованием MALDI-TOF-MS или LC-ESI-MS. Если возможно обнаружить пик для C4 при 1896,1 m/z и пик для C3f при 2021,1 m/z, образец выдерживали при комнатной температуре более 4 ч. Использование таких образцов для протеомного анализа невозможно [9].

Условия хранения. Проверку условий хранения цитратной плазмы можно осуществить методом измерения активности белка S с помощью анализа активности коагуляции: если активность ниже 50%, образец хранился при –80 °C более 9 лет [9].

Пригодность биологического материала для исследований в различных областях

Гемолиз. Можно проверить наличие Hb-загрязнения и убедиться, что образец пригоден для протеомного анализа или анализа на основе микроРНК с помощью ELISA или спектрофотометрии. Если концентрация Hb выше 50 мг/л, произошел гемолиз, проба считается загрязненной Hb [9].

Воспаление. Проверить наличие маркера воспаления в образце можно, измерив концентрацию С-реактивного белка (СРБ) с помощью ИФА или нефелометрии. Если концентрация выше 10 мг/л, образец показывает наличие воспаления [9].

Пригодность для исследования сердечно-сосудистых заболеваний. Для установления пригодности для исследований необходимо измерить:

а) уровень BNP, NT-proBNP, используя ИФА;

б) уровень ANFPTL3, используя ИФА или электрохемилюминесцентный иммуноанализ;

в) уровень СК-MB и ET-1, используя ИФА;

г) ММР-3 и уровень ММР-9 с использованием ИФА;

д) уровень тропонина I и тропонина Т с использованием ИФА или электрохемилюминесцентного иммуноанализа.

Эти белки должны выявляться, чтобы образец можно было использовать в исследованиях сердечно-сосудистых заболеваний [9].

Пригодность для исследования заболеваний печени. Необходимо измерить уровни аланинаминотрансферазы (АЛТ) с помощью флюороиммуноанализа. АЛТ должен быть обнаружим, чтобы проба подходила для исследования заболеваний печени [9].

Пригодность с целью исследования аутоиммунитета. Для исследований необходимо определить уровень фактора некроза опухоли-α (TNF-α) с помощью чувствительного ИФА. TNF-α должен быть обнаружим, чтобы образец соответствовал критериям исследования аутоиммунитета [9].

Пригодность для исследований в области эндокринологии и диабета. Необходимо измерить уровень пептида инсулина C и инсулина как предшественника фактора роста II с помощью ИФА, флюороимуноанализа или радиоиммуноанализа; уровень альдостерона и соматомедина С с помощью ИФА. Эти белки должны быть обнаружены, чтобы образец соответствовал исследованиям в области эндокринологии [9].

Пригодность для исследования воспаления и иммунологии. Необходимо измерить уровень комплемента C с помощью нефолометрии или энзиматического иммуноанализа; уровень ICAM-1и TNF-α с помощью энзиматического иммуноанализа. Эти белки должны быть обнаружены, чтобы образец соответствовал исследованиям в области воспаления и иммунологии [9].

Пригодность с целью исследования в онкологии. Для проверки необходимо: использовать ИФА M65 EpiDeath; измерить уровень VCAM-1 с помощью ИФА. Эти белки должны обнаруживаться, чтобы образец соответствовал исследованиям в области онкологии [9].

Пригодность для целей исследований в области заболеваний опорно-двигательного аппарата. Необходимо измерить уровень MID-остеокальцина, остеокальцина и кальцитонина, а также С-терминального телопептида и коллагена типа 1, интактного паратиреоидного гормона (ПТГ) с помощью ИФА или электрохемилюминесцентного иммуноанализа. Эти белки должны быть обнаружены для того, чтобы образец мог быть использован в исследованиях в области заболеваний опорно-двигательного аппарата [9].

Пригодность для исследования в области питания. Необходимо измерить уровень витамина B₁₂ с помощью электрохемилюминесцентного иммуноанализа. Витамин B₁₂ должен быть обнаружим, чтобы образец соответствовал критериям исследования питания [9].

Пригодность для исследования нейродегенеративных заболеваний. Для установления пригодности для подобных исследований необходимо измерить уровень амилоида Aβ42 с помощью ИФА; нейрон-специфический уровень энолазы с помощью иммуноанализа Kryptor, ИФА или электрохемилюминесцентного иммуноанализа. Эти белки должны обнаруживаться, чтобы образец соответствовал исследованиям нейродегенеративных заболеваний [9].

Контаминация тромбоцитами. Проверить наличие тромбоцитов и убедиться, что образец пригоден для анализа на микрочастицы или ccfRNA, можно, выполнив подсчет клеток. Если концентрация тромбоцитов ниже 10 4 /мл, считается, что отсутствует значимая контаминация образца плазмы тромбоцитами [9].

Активация тромбоцитов. Также можно проверить активацию тромбоцитов и убедиться, что образец пригоден для исследования биомаркеров, на которые влияет активация тромбоцитов путем измерения концентрации β-тромбоглобулина (βTG) с помощью ELISA. Если концентрация выше 200 нг/мл, происходит активация тромбоцитов [9].

Гемолиз. Проверить наличие загрязнения Hb и убедиться, что образец пригоден для протеомного анализа или анализа микроРНК, можно, выполнив ELISA или спектрофотометрию. Если концентрация Hb выше 20 мг/л, произошел гемолиз и проба считается загрязненной Hb [9].

Воспаление. Проверить выраженность воспаления в образце можно, измерив концентрацию СРБ с помощью ИФА или нефелометрии. Концентрация выше 10 мг/л свидетельствует о воспалении [9].

Пригодность для исследования сердечно-сосудистых заболеваний. Для установления пригодности для исследований необходимо измерить уровень тропонина I и тропонина Т, используя ИФА или электрохемилюминесцентный иммуноанализ; уровень вазоактивного интестинального пептида (VIP), используя ИФА.

Эти белки должны быть обнаружены, чтобы образец соответствовал исследованиям сердечно-сосудистых заболеваний [9].

Пригодность для исследования липидного обмена. Для проверки можно измерить уровни активности белка-переносчика CETР с помощью флюороиммуноанализа. CETP должен быть обнаружим, чтобы проба соответствовала требованиям для исследования липидного обмена/липидомного анализа [9].

Пригодность для исследования аутоиммунитета. Для данного исследования можно измерить TNF-α с помощью чувствительного ИФА. TNF-α должен быть обнаружим, чтобы образец соответствовал критериям исследования аутоиммунитета [9].

Пригодность для целей исследований в области эндокринологии, включая диабет. Для оценки пригодности можно измерить уровень глюкагоноподобного пептида 1, используя ИФА или радиоиммуноанализ; уровень аденокортикотропного гормона, используя электрохемилюминесцентный иммуноанализ или радиоиммуноанализ; уровень альдостерона и соматомедина С, используя ИФА.

Эти белки должны быть обнаружены, чтобы образец соответствовал исследованиям в области эндокринологии, включая сахарный диабет [9].

Пригодность для исследования воспаления и иммунологии. Для проверки можно измерить: уровни комплемента С с помощью нефолометрии или энзиматического иммуноанализа; уровень ICAM-1 с помощью энзиматического иммуноанализа. Эти белки должны быть обнаружены, чтобы образец соответствовал исследованиям воспаления и иммунологии [9].

Пригодность для целей исследований заболеваний опорно-двигательного аппарата. Необходимо измерить уровень C-терминального телопептида и коллагена I типа, используя ИФА или электрохемилюминесцентный иммуноанализ. Эти белки должны обнаруживаться, чтобы образец мог быть использован для исследований в области заболеваний опорно-двигательного аппарата [9].

Пригодность для исследования нейродегенеративных заболеваний. Для установления пригодности для исследований можно измерить уровень амилоида Aβ42 с помощью ИФА. Aβ42 должен быть детектируемым, чтобы проба подходила для исследования нейродегенеративных заболеваний [9].

Пригодность для исследования коагуляции (только для цитратной плазмы). Для проверки можно измерить уровень антифактора Ха и фибриногена; фрагменты протромбина 1 и 2 и активность ингибитора активатора плазминогена типа 1 или антиген с использованием ИФА; анализ образования тромбина с использованием флюороиммуноанализа; антиген ТРА с использованием ИФА. Эти белки должны обнаруживаться, чтобы образец соответствовал необходимому качеству для изучения процесса коагуляции [9].

Заключение

Высокое качество биоматериалов и связанных с ними данных имеет важнейшее значение для достижения надежных и воспроизводимых научных результатов. Результаты исследований, приведенные в данном обзоре, свидетельствуют об изменении качества биоматериала при нарушении правил на любой стадии преаналитического этапа. Для обеспечения необходимого качества образцов сыворотки и плазмы крови могут использоваться специальные методы целенаправленного К.К. Такой К.К. может осуществляться как на этапе поступления биообразцов в биобанк, так и на этапе непосредственного применения биоматериала, пуска в работу в рамках конкретного научного проекта. Процессы сбора, обработки, хранения и выдачи биоматериалов должны быть проведены и задокументированы по стандартам. Именно выполнение стандартов всех стадий преаналитического этапа гарантирует должное качество биообразцов. При необходимости (в случае сомнения в качестве биоматериала) следует использовать методы оценки качества. В настоящее время процесс поиска маркеров качества биообразцов продолжается в ведущих биобанках мира. Наиболее значимые результаты в этой области получают специалисты отдела КК биобанка Люксембурга (IBBL) [19].

Наличие биобанка в структуре научного процесса обеспечивает жесткое соблюдение стандартизированных условий проведения преаналитического этапа и играет ключевую роль в контроле и гарантии качества биообразцов, предназначенных для научных исследований.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Источник