Антилейкоцитарные антитела что это такое
Антилейкоцитарные антитела что это такое
Аутоантитела класса IgA к компонентам цитоплазмы нейтрофилов, уровень которых в крови повышается при активном течении геморрагического васкулита (пурпуры Шейнляйн – Геноха) и некоторых других аутоиммунных заболеваниях.
Иммуноглобулины класса А к цитоплазме нейтрофилов, АНЦА IgA.
Синонимы английские
Anti-neutrophil cytoplasmic antibody (ANCA), IgA.
Непрямая реакция иммунофлюоресценции.
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Как правильно подготовиться к исследованию?
Общая информация об исследовании
Антитела к цитоплазме нейтрофилов (АНЦА) – группа аутоантител к различным белкам цитоплазмы и содержимому азурофильных гранул нейтрофилов. Существует несколько классов иммуноглобулинов, которые могут быть обнаружены в крови: IgG, IgA, IgM.
Определение АНЦА IgMв серодиагностике аутоиммунных заболеваний не применяется. АНЦА IgG имеют значение при обследовании пациентов с болезнью Вегенера, синдромом Гудпасчера и выявляются при некоторых других аутоиммунных заболеваниях. Мишенями АНЦА IgG могут быть протеиназа-3, миелопероксидаза, лактоферрин, эластаза, белок BPI (мембранный бактерицидный белок), катепсин G. Однако исследования показали, что антигенами для АНЦА IgA, в отличие от IgG, вероятнее всего, выступают другие компоненты цитоплазмы нейтрофилов. Антитела класса IgA направлены против аутоантигенов с массой 51 килодальтон, которые, возможно, являются мембран-ассоциированными белками. Патогенетическое значение появления АНЦА IgА и их роль в течении аутоиммунных заболеваний на данное время окончательно не выяснены. Известно, что они способны образовывать депозиты и повреждать мелкие сосуды (венулы, артериолы, капилляры), однако связь между тяжестью течения заболевания и уровнем АНЦА IgА в крови не обнаружена. Наиболее часто АНЦА IgА выявляются у детей и взрослых с геморрагическим васкулитом.
Пурпура Шейнляйн – Геноха (геморрагический васкулит) – системное заболевание с воспалительным поражением стенки мелких сосудов, которое характеризуется появлением мельчайших кровоизлияний в различных органах и тканях. Клинически болезнь проявляется кожными высыпаниями в виде петехий и/или пальпируемой пурпуры, болями в суставах и животе. В 10-60 % случаев возможно вовлечение в патологический процесс почек с легкой гематурией и протеинурией, которое редко осложняется нефротическим синдромом, почечной недостаточностью и артериальной гипертензией. Поражение почек при геморрагическом васкулите практически невозможно отличить от IgA-нефропатии (болезни Берже). Однако при IgА-нефропатии аутоантитела АНЦА IgА не выявляются, в то время как у пациентов с активно текущим геморрагическим васкулитом они обнаруживаются в 79-82 % случаев. Поэтому АНЦА IgA рассматриваются в качестве диагностического маркера геморрагического васкулита при дифференциальной диагностике пурпуры Шейнляйн – Геноха и IgA-нефропатии. Уровень данного типа антител коррелирует с активностью болезни, но не связан с тяжестью течения пурпуры Шейнляйн – Геноха и повреждением почек. При затухании активности болезни и выздоровлении АНЦА IgА перестают определяться в крови.
Некоторые исследования показали, что АНЦА IgА выявляются при аутоиммунном гепатите и первичном склерозирующем холангите без какой-либо связи или зависимости с клиническим течением и активностью заболеваний.
Для чего используется исследование?
Когда назначается исследование?
Что означают результаты?
Референсные значения: Причины повышения:
Антилейкоцитарные антитела что это такое
Получить результаты
Компания «Новые Медицинские Технологии»
Диагностика аутоиммунных заболеваний и синдромов
Показания к назначению анализа: диагностика и дифференциальная диагностика системных заболеваний соединительной ткани (особенно СКВ), аутоиммунного гепатита, вирусного гепатита с аутоиммунным компонентом (индуцированным вирусами или лечебными вмешательствами), первичного билиарного цирроза, рассеянного склероза; выявление аутоиммунного компонента при различных заболеваниях, в патогенезе которых может играть роль аутоагрессия. Материал для исследования: сыворотка крови.
Для определения антинуклеарных антител используется методика непрямой иммунофлюоресценции с использованием в качестве субстрата клеток культивируемой линии Нер-2.
Использование в качестве субстрата клеток злокачественной культивируемой линии благодаря их особенностям (высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение, крупные размеры, наличие большого количества митозов) позволяет оценить различные типы свечения, характерные для присутствия в образце крови широкого спектра антител к различным антигенам, имеющих различные клинические ассоциации.
Следует иметь в виду, что часть из определяемых типов свечения является высокоспецифичной, четко ассоциирована с определенными заболеваниями и имеет вполне определенную диагностическую значимость, в особенности при выявлении в высоких титрах; однако некоторые антитела к различным антигенам могут давать сходные типы свечения, в таких случаях может требоваться дальнейшее обследование для уточнения конкретного антигена, к которому направлены аутоантитела. С другой стороны, определенный тип антител может встречаться при нескольких нозологических формах. Существуют также антитела (они встречаются редко), реагирующие исключительно с компонентами веретенного аппарата клеток; обычно они не связаны с аутоиммунными заболеваниями, и их обнаружение расценивается как ложнопозитивный, не имеющий клинических ассоциаций результат.
Все вышеперечисленные особенности обязательно отражаются в лабораторном заключении, где, помимо указания типа свечения и соответствующего ему наиболее вероятного типа антител, даются также рекомендации по трактовке результатов в смысле возможной ассоциации с конкретными нозоформами или синдромами, а также необходимые дополнительные лабораторные исследования.
ТРАКТОВКА РЕЗУЛЬТАТОВ.
У здоровых лиц моложе 60 лет следует ожидать отрицательных результатов на антитела к компонентам ядра и цитоплазмы; в низком титре (слабоположительный результат) эти антитела все же обнаруживаются у 2-3% (по некоторым данным, до 10%) практически здоровых людей, однако никогда нельзя предсказать, не разовьется ли у этих людей аутоиммунное заболевание в будущем (так, по данным некоторых авторов, антитела к ДНК начинают выявляться задолго до начала клинических проявлений СКВ, латентный период может продолжаться годами). После 60 лет частота слабоположительных результатов с возрастом постоянно растет. Клиническая значимость этих результатов остается неясной; как правило, они выявляются только в первичном (скрининговом) разведении 1:40. Исходя из этого, при выявлении положительного результата в скрининговом титре 1:40 всегда необходимо титрование, как минимум до диагностического титра 1:80. В любом случае представляется целесообразным последующее регулярное клинико-лабораторное наблюдение лиц, у которых выявлены ANA в низком титре.
ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА Положительный результат предполагает наличие определенных заболеваний (см. ниже), однако, как и результат любых лабораторных исследований, может нуждаться в подтверждении или уточнении с помощью других методов, а также в установлении клинико-лабораторных корреляций.
Надо иметь в виду, что различные лекарственные препараты могут вызывать образование аутоантител (гидралазин, прокаинамид, фенитоин, карбамазепин, изониазид, хлорпромазин, пеницилламин, леводофа, пенициллин, фенилбутазон, пероральные контрацептивы, хинидин). Наиболее частыми мишенями для этих ятрогенных аутоантител являются ядерные гистоны, что приводит к развитию гомогенного или гомогенного периферического типа свечения.
ЗАБОЛЕВАНИЯ, ПРИ КОТОРЫХ ЧАЩЕ ВСЕГО ВЫЯВЛЯЮТСЯ
АНА ИЛИ АНТИЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА
— системная красная волчанка (СКВ),
— ревматоидный артрит,
— синдром Шегрена,
— склеродермия,
— дерматомиозит,
— узелковый периартериит и др.;
Антинуклеарные антитела также могут выявляться при острых и хронических лейкозах, приобретенной гемолитической анемии, болезни Вальденстрема, малярии, хронической почечной недостаточности, тромбоцитопениях, лимфопролиферативных заболеваниях, миастении и тимомах.
Клиническое значение атипичных антинейтрофильных антител у пациентов с АНЦА-ассоциированными васкулитами
Определить частоту выявления и клиническое значение атипичных антинейтрофильных цитоплазматических антител (АНЦА) к лизосомальному мембранному гликопротеину 2 (LAMP2) у пациентов с АНЦА-ассоциированными васкулитами (ААВ).
Материалы и методы
В исследование были включены 59 пациентов (22 мужчины и 37 женщин, средний возраст 52,5±14,3 лет) с впервые диагностированным ААВ (n=35) или рецидивом заболевания (n=24). Диагноз заболевания устанавливали в соответствии с критериями Американской коллегии ревматологов и/или определением, принятом на конференции в Чапел-Хилле в 2012 г. Дополнительным критерием включения была величина суммарного балла BVAS (v.3) ≥3. Контрольную группу составили 36 здоровых добровольцев, сопоставимых по полу и возрасту. Концентрацию АНЦА к протеиназе-3, миелопероксидазе и LAMP-2 определяли с помощью иммуноферментного анализа.
На основании анализа концентрации антител к LAMP-2 в контрольной группе был установлен верхний порог референсных значений, равный 48,9 нг/мл. Медиана концентрации антител к LAMP-2 в группе пациентов с ААВ (42,1 нг/мл) была достоверно выше, чем в контрольной группе (37,1 нг/мл, p Заключение
Полученные данные демонстрируют низкую информативность концентрации атипичных АНЦА к LAMP-2 в оценке активности ААВ.
Васкулиты, ассоциированные с антителами к цитоплазме нейтрофилов (AНЦА), представляют собой группу системных аутоиммунных заболеваний, характерными чертами которых являются некротизирующее поражение стенок преимущественно мелких сосудов и наличие AНЦA к протеиназе-3 (ПР3) или миелопероксидазе (MПO) в циркуляции. АНЦА активируют праймированные нейтрофилы, которые оказывают повреждающее действие на мелкие сосуды, что считают одним из ключевых этапов патогенеза АНЦА-ассоциированных васкулитов (ААВ) [1]. У части пациентов с ААВ, прежде всего с локальным вариантом гранулематоза с полиангиитом и эозинофильным гранулематозом с полиангиитом, обнаружить АНЦА в сыворотке крови не удается. Кроме того, концентрация антител плохо коррелирует с активностью заболевания и не позволяет надежно прогнозировать рецидивы ААВ. Помимо ПР3 и МПО, AНЦА могут быть направлены против других молекул, входящих в состав нейтрофилов, в том числе эластазы, дефензина, лактоферрина, α-енолазы, азуроцидина, бактерицидного белка, повышающего проницаемость, катепсина G и лизосомального мембранного гликопротеина-2 (LAMP-2). Патогенетическое значение этих аутоантител (так называемых атипичных АНЦА) остается неясным.
Основные функции LAMP-2, гликозилированного мембранного белка, экспрессируемого в лизосомах и на поверхности нейтрофилов и эпителия почечного клубочка, – поддержание целостности лизосом, регуляция молекулярного транспорта через мембраны лизосом и слияния лизосом с фагосомой, опосредованная шапероном аутофагия и презентация [2]. Генетический дефицит LAMP-2 у пациентов с болезнью Данона приводит к тяжелому поражению сердца и мышечной ткани, опосредованному дисфункцией лизосом. Антитела к LAMP-2 были первоначально обнаружены Kain и соавт. у 13 из 15 пациентов с активным ААВ и малоиммунным гломерулонефритом с полулуниями [3]. В экспериментальных работах было показано, что пассивная иммунизация рекомбинантным кроличьим иммуноглобулином G к LAMP-2 или активная иммунизация рекомбинантным FimH, бактериальным адгезивным белком грамотрицательных бактерий, имеющим один общий с LAMP-2 эпитоп, могут индуцировать развитие малоиммунного гломерулонефрита с полулуниями у крыс, что подтверждает участие антител к LAMP-2 в патогенезе заболевания [4]. Однако результаты клинических исследований, в которых изучалось значение антител к LAMP-2 у пациентов с ААВ, оказались противоречивыми.
Целью исследования было изучение частоты выявления и клинического значения антител к LAMP-2 у пациентов с активным ААВ.
Материал и методы
В исследование включали пациентов с впервые диагностированным ААВ или рецидивом заболевания, у которых суммарный Бирмингемский индекс активности васкулита (BVAS, v.3) составлял по крайней мере 3 балла. Диагноз гранулематоза с полиангиитом (ГПА) и микроскопического полиангиита (МПА) устанавливали в соответствии с критериями Американской коллегии ревматологов (1990 г.) и/или определением, принятом на конференции в ЧапелХилле в 2012 г. [5,6]. Пациентов с эозинофильным гранулематозом с полиангиитом в исследование не включали. Все пациенты были набраны в Клинике им. Е.М. Тареева Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (г. Москва) и Влади мирской областной клинической больнице. Контрольную группу составили 36 здоровых добровольцев, в том числе 9 мужчин и 27 женщин в возрасте в среднем 55,7±12,4 года. Все участники исследования дали письменное информированное согласие, одобренное локальным этическим комитетом Первого МГМУ им. И.М. Сеченова.
Серопозитивность к антителам LAMP-2 определяли как значение, превышающее верхнюю границу доверительного интервала (97,5-й процентиль) контрольной группы после логарифмического преобразования первичных данных [7].
Результаты
Характеристика больных. В исследование были включены 59 пациентов, в том числе 22 мужчины и 37 женщин (средний возраст 52,5±14,3 лет), с впервые диагностированным ААВ или рецидивом заболевания (табл. 1). У 6 пациентов с АНЦА-негативным локализованным вариантом ГПА диагноз был подтвержден при морфологическом исследовании. У всех пациентов имелся активный васкулит, а медиана индекса BVAS составила 16,5. У 35 больных ААВ был диагностирован впервые. У 23 из них к моменту забора сыворотки крови уже была начата иммуносупрессивная терапия глюкокортикостероидами и иммуносупрессивными препаратами по месту жительства (табл. 1), в то время как 12 пациентов не получали лечение до момента забора биообразцов. Двадцать четыре пациента с рецидивом ААВ продолжали поддерживающую иммуносупрессивную терапию глюкокортикостероидами и/или цитостатиками на момент обследования.
| Показатели | Величина |
|---|---|
| Примечание: *Медиана дозы преднизолона – 12 (13; 22) мг. **Индукционная терапия: ритуксимаб (n=4), циклофосфамид (n=20), метотрексат (n=3) или микофенолата мофетил (n=1). ***Поддерживающая терапия: монотерапия глюкокортикоидами (n=12), азатиоприн (n=8), метотрексат (n=2) или микофенолата мофетил (n=2). | |
| Женщины, n (%) | 37 (62,7) |
| Средний возраст, лет | 52,5±14,3 |
| Диагноз, n (%) | |
| ГПА | 41 (69,5) |
| МПА | 18 (30,5) |
| Впервые диагностированный ААВ, n (%) | 35 (59,3) |
| Висцеральные поражения, n (%) | |
| Легкие | 29 (49,1) |
| Почки | 37 (62,7) |
| ЛОР-органы | 38 (64,4) |
| Орган зрения | 14 (23,7) |
| АНЦА, n (%) | |
| ПР3 | 36 (61,0) |
| МПО | 13 (22,0) |
| Неизвестной специфичности | 4 (6,8) |
| Отрицательные | 6 (10,2) |
| Предшествующая иммуносупрессия, n (%) | 47 (79,7) |
| Глюкокортикостероиды* | 47 |
| Индукционная терапия** | 23 |
| Поддерживающее лечение*** | 24 |
| Лабораторные показатели | |
| Креатинин сыворотки, мкмоль/л | 105,2 (95,7, 200,7) |
| СОЭ, мм/ч | 55,0 (38,0, 64,0) |
| С-реактивный белок, мг/л | 10,2 (9,8, 36,7) |
| BVAS | 16,5 (13,6, 16,9) |
Результаты определения антител к LAMP-2. У пациентов с AAВ медиана концентрации антител к LAMP-2 (42,1 нг/мл) была достоверно выше, чем в контрольной группе (37,1 нг/мл, р 
Рис. 1. Концентрации антител к LAMP-2 (нг/мл) в сыворотке крови пациентов с ААВ и здоровых добровольцев. Горизонтальная линия – верхнее пороговое значение референсного диапазона.
Все пациенты, у которых был повышен уровень антител к LAMP-2, были серопозитивными по ПР3АНЦА. Однако медиана концентрации антител к LAMP-2 была сопоставимой у пациентов с ПР3-АНЦА (41,4 нг/мл) и МПО-АНЦА (44,2 нг/мл, p=0,884). Ни у одного из шести АНЦА-негативных пациентов не было обнаружено повышения антител к LAMP-2. Кроме того, среди 12 пациентов с впервые установленным диагнозом AAВ, которые не получали какую-либо иммуносупрессивную терапию, антитела к LAMP-2 были обнаружены только в 1 (8,3%) случае.
Результаты повторного определения антител к LAMP-2. У 28 пациентов c ААВ концентрацию антител к LAMP-2 определяли повторно через 3-38 мес. (медиана 16 мес.) после достижения ремиссии заболевания на фоне иммуносупрессивной терапии. В целом медиана концентрации антител к LAMP-2 достоверно не отличалась в активную фазу и в фазу ремиссии ААВ: 44,0 (38,76, 45,41) и 39,8 (35,96, 43,38) нг/мл, соответственно (p=0,079). У всех 6 пациентов с ААВ, серопозитивных по антителам к LAMP-2, концентрация антител нормализовалась после достижения ремиссии, однако у одного серонегативного пациента она увеличилась после достижения ремиссии и при контрольном обследовании превысила пороговое значение (рис. 2).
Обсуждение
Результаты нашего исследования свидетельствуют о том, что антитела к LAMP-2 не могут быть использованы для оценки активности ААВ и, по всей видимости, играют незначительную роль в патогенезе заболевания. Хотя медиана концентрации антител к LAMP-2 в основной группе достоверно превышала таковую в контрольной группе, уровни антител были выше референсного значения лишь у 10,6% пациентов с рецидивирующим AAВ и у 8,3% пациентов с впервые диагностированным васкулитом. Кроме того, даже у этих пациентов степень повышения концентрации антител к LAMP-2 была умеренной, в то время как АНЦА к ПР3 и МПО были обнаружены в высоких титрах у 90% пациентов с активным AAВ. Антитела к LAMP-2 также не имели диагностической ценности у пациентов с АНЦА-отрицательным вариантом AAВ. После достижения ремиссии наблюдалось статистически незначимое изменение средних уровней антител к LAMP-2, хотя у 6 серопозитивных пациентов была отмечена нормализация их концентрации.
В отличие от нашего исследования, в работе Kain и соавт. антитела к LAMP-2 были обнаружены у 80-91% из 64 пациентов с впервые диагностированным AAВ, причем была показана высокая частота совпадения результатов их определения (80,5%) тремя различными методами, включая ИФА, вестерн-блоттинг и реакцию непрямой иммунофлюоресценции [8]. Частота выявления антител к LAMP-2 была сопоставимой у пациентов с антителами к МПО и ПР3. Уровень антител к LAMP2 быстро снижался после начала иммуносупрессивной терапии и нередко вновь нарастал во время рецидива заболевания. Следует отметить, что антитела к LAMP-2 не были выявлены у всех пациентов с другими заболеваниями почек и у 90% пациентов с системной красной волчанкой. В более позднем исследовании Peschel и соавт. обнаружили антитела к LAMP-2 у 8 (73%) из 11 пациентов с АНЦА-отрицательным малоиммунным фокальным некротизирующим гломерулонефритом [9]. В нашей работе индукционная иммуносупрессивная терапия также приводила к быстрому снижению концентрации антител к LAMP-2 ниже порогового значения у серопозитивных пациентов, но в то же время у одного пациента повышение концентрации антител к LAMP-2 было зарегистрировано после достижения ремиссии. При этом предшествующая иммуносупрессия не может объяснить отсутствие антител к LAMP-2 при активном ААВ, учитывая очень низкую частоту их выявления и у пациентов с впервые диагностированным AAВ.
Результаты исследования Kain и соавт. не были подтверждены в работе Roth и соавт., которые определяли антитела к LAMP-2 у 671 пациента из двух американских центров с помощью коммерческого набора ИФА [10]. Референсный диапазон концентрации антител был установлен на основании результатов обследования контрольной группы здоровых добровольцев. Антитела к LAMP-2 были обнаружены у 21% из 329 АНЦА-позитивных пациентов с малоиммунным гломерулонефритом с полулуниями, у 29% из 104 АНЦА-негативных пациентов с малоиммунным гломерулонефритом с полулуниями и у 16% из 104 пациентов с инфекцией мочевых путей, вызванной FimH-положительными бактериями. В целом титры антител к LAMP-2 были низкими, значимо не различались у пациентов с ПР3-АНЦА или МПО-АНЦА и не коррелировали с показателями активности заболевания. Кроме того, наличие антител к LAMP-2 не было подтверждено методом вестерн-блоттинга или в реакции непрямой иммунофлюоресценции. У крыс линии Wistar Kyoto, которым вводили антитела к LAMP-2, не было отмечено развития гломерулонефрита. Последнее представляется немаловажным, поскольку роль МПО-АНЦА в патогенезе ААВ была доказана в том числе благодаря успешным экспериментам на мышиных моделях [11].
Различные методики определения антител могут по крайней мере частично объяснить противоречивые результаты разных исследований [12]. Kain и Rees предположили, что наблюдаемые противоречия могут быть разрешены после разработки надежных стандартизованных методов определения антител к LAMP-2, которые пока отсутствуют [2]. Тем не менее, результаты исследования Roth и соавт. [10] и нашего исследования свидетельствуют о том, что антитела к LAMP-2 не имеют существенного значения у пациентов с ААВ. Хорошо известно, что результаты более половины научных исследований не подтвержаются в последующих работах [13]. Причем следует учитывать, что исследования с отрицательными результатами публикуются реже и спустя больший промежуток времени, чем работы с положительными результатами [14].
Наше исследование имеет ряд ограничений. Количество пациентов было относительно небольшим, однако выборка была достаточной для проведения статистического анализа и репрезентативной по отношению к общей популяции пациентов с AAВ, поскольку включала в себя пациентов с МПО-АНЦА и ПР3АНЦА, рецидивирующим или недавно диагностированным AAВ и АНЦА-отрицательным вариантом заболевания. Более того, почти у половины пациентов определение антител было выполнено повторно после индукции ремиссии с использованием различных иммунодепрессантов. Учитывая очень низкую частоту выявления антител к LAMP-2, вряд ли, следует ожидать иных результатов в более крупных исследованиях.
Заключение
Результаты нашего исследования свидетельствуют о том, что антитела к LAMP-2 не следует использовать для оценки активности заболевания у пациентов с AAВ.
Антилейкоцитарные антитела что это такое
Одним из принципиальных подходов повышения иммунологической безопасности гемокомпонентной терапии является использование крови доноров, гистосоместимых с реципиентом. Определяющее значение для индивидуальности организма играет система лейкоцитарных антигенов человека (human leukocyte antigens, HLA-система), являющаяся главным комплексом гистосовместимости человека.
Одним из основных методов профилактики этих осложнений гемотрансфузионной терапии является использование компонентов крови от гистосовместимых доноров.
АНТИГЕНЫ ЛЕЙКОЦИТОВ, ТРОМБОЦИТОВ И БЕЛКОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ, НLА-АНТИГЕНЫ
HLA-антигены I класса экспрессированы на большинстве соматических клеток, причем уровень их экспрессии тканеспецифичен. Максимальная экспрессия выявлена на лимфоидной ткани.
Серологическое определение HLA-антигенов
Анализ антигенного состава лимфоцитов осуществляется с помощью набора гистотипирующих сывороток. Набор сывороток, определяющих антигены А, В и С локусов системы HLA, должен выявлять не менее 30 наиболее часто встречающихся и редких антигенов системы HLA. Фенотипирование лимфоцитов проводят в микролимфоцитотоксическом тесте.
Анти-HLA-антитела наиболее частая причина негемолитических посттрансфузионных реакций и рефрактерности к аллогенным гемокомпонентам. Естественная анти-HLA-сенсибилизация развивается у женщин во время беременности к аллоантигенам плода. Частота аллосенсибилизации при беременности составляет от 5 до 25%. Специфичность формирующихся анти-HLA-антител обычно широкая, чаще анти-В, чем анти-А. У женщин, имевших четыре и более беременности, часто формируются антитела к одному или двум антигенам гаплотипа мужа.
Развитие HLA-сенсибилизации при трансфузиях обусловлено примесью лимфоцитов, содержащихся в большинстве гемокомпонентов. Практически свободны от этой примеси только размороженные криоконсервированные эритроциты. Пороговой величиной, так называемой дозой иммуногенной нагрузки, является доза в 5 млн лимфоцитов.
На развитие аллосенсибилизации значительное влияние оказывает состояние иммунной системы реципиента. Так, у больных с выраженным иммунодефицитом при сепсисе, ожоговой болезни клинически значимая сенсибилизация развивается значительно реже, чем у лиц не имеющих угнетения иммунной системы (гипопластическая анемия, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки и др.). Имеются наблюдения, свидетельствующие, что у больных, получавших гемотрансфузий, чаще наблюдаются рецидивы колоректального рака и опухолей других локализаций.
| Таблица 18.18 Антигены, найденные только на гранулоцитах | |||
| Гены (локус) | Антигены | Фенотипическая частота | Генотипическая частота |
| NA | NA1 NA2 | 61,2 89,6 | 0,32 0,68 |
| NB | NB1 | 90,8 | 0,72 |
| NC | NC1 | 94,5 | 0,80 |
| ND | ND1 | 98,5 | 0,88 |
| NE | NE1 | 22,9 | 0,12 |
| HGA-3 | HGA-3a HGA-3b HGA-3c HGA-3d HGA-3e | 21,5 23,9 16,1 52,6 17,2 | 0,11 0,13 0,08 0,31 0,09 |
| GA | Al,2, 3, 4, 5 | ||
| GB | B 20, 21, 22, 23,24 | ||
| GC | C40, 41, 42,43 | ||
| GR | GR1 GR2 | 0,18 0,35 | |
Гранулоцит-специфичные антитела могут отвечать за различные клинические синдромы, в частности аутоиммунную нейтропению новорожденных, фебрильные реакции при переливании крови, связанное с трансфузией поражение легких, аутоиммуную нейтропению.
МЕТОДЫ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО ПОДБОРА СОВМЕСТИМОГО ДОНОРА В ТРАНСФУЗИОЛОГИИ
Важным этапом иммунологического подбора является выполнение комплекса серологических проб на индивидуальную совместимость по аллоантигенам лейкоцитов, тромбоцитов и иммуноглобулинов. При этом используются лимфоцитотоксическая реакция, реакции лейкоцитоагглютинации и тромбоцитоагглютинации. Эти реакции могут осуществляться в двух ариантах: исследование сыворотки реципиента с клетками крови донора и сыворотки донора с форменными элементами реципиента.
Техническое оснащение микрометодов включает в себя: микрошприцы, которые должны дозировать объем от 1 до 5 мкл, микрокамеры типа Терасаки с 60 лунками в форме усеченного конуса емкостью 0,01 мл. Площадка лунки позволяет производить микроскопирование клеток непосредственно в камере. Для предотвращения высыхания столь малых объемов реагирующей смеси лунки камеры перед распределением всех реагентов заполняются вазелиновым маслом.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕЙКОЦИТАРНЫХ АНТИГЕНОВ
Производится при аллогенных трансплантациях костного мозга для оценки гистосовместимости донора и реципиента, а также при трансфузиях крови, эритроцитарной массы, лейкоцитоконцентрата, лейкотромбовзвеси для предупреждения посттрансфузионных осложнений.
Выделение лимфоцитов в градиенте плотности
Приготовление градиента плотности. Градиент плотности приготавливается путем смешивания 96 мл 9% раствора фиколла (приготовленного на дистиллированной воде) и 40 мл 34% раствора верографина. 34% раствор верографина готовится из 75% раствора верографина путем разведения дистиллированной водой. Плотность смеси должна быть в пределах 1,076-1,078. Раствор может быть автоклавирован и использован для выделения лимфоцитов в стерильных условиях.
Выделение клеток: кровь, полученную путем венепункции, дефибринируют, затем смешивают в равных количествах с 0,9% раствором хлорида натрия. В пробирку наливают 2,5 мл смеси фиколл-верографин, а затем осторожно наслаивают 8 мл разведенной крови. Пробирки центрифугируют 30 мин при 1450 об./мин при температуре +18°С. После центрифугирования из пробирок пипеткой собирают кольцо, образованное на границе двух жидкостей, в котором находятся лимфоциты. Полученную взвесь лимфоцитов дважды отмывают раствором Хенкса.
Получение, обработка, стандартизация и хранение комплемента
Результат лимфоцитотоксической реакции при всех прочих равных условиях во многом зависит от качества используемого комплемента. Наиболее активной комплемент-содержащей средой является пул сывороток крови кролика. Для приготовления комплемента необходимо взять смесь сывороток крови 8-10 кроликов, не содержащих ксеноантител к лимфоцитам человека.
Техника постановки микролимфоцитотоксической реакции
Причины ложных результатов и их контроль. Бактериальное загрязнение сыворотки и других реактивов, используемых в реакции, может быть причиной ложноположительных результатов; недостаточно активные сыворотки, малая комплементарная активность сывороток, используемых в качестве комплемента, дают ложноотрицательные результаты.
Реакция смешанной культуры лимфоцитов (микровариант)
Для выполнения реакции смешанной культуры лимфоцитов необходимы следующие реагенты: 74% верографин; фиколл (М.м. 400000); среда 199; митомицин С; гепарин.
Кровь берут из вены стерильно с последующим дефибринированием или в раствор гепарина (15 единиц гепарина на 1 мл крови) и смешивают с равным объемом среды 199. Для получения лимфоцитов используют смесь фиколл-верографин.
После двукратного отмывания клеток надосадочную жидкость удаляют, осадок ресуспендируют в среде 199 с добавлением 30% фетальной телячьей сыворотки и доводят до концентрации 1 · 10 6 в 1 мл (отвечающая популяция, ОП).
Лимфоциты стимулирующей популяции (СП) ресуспендируют в 10 мл среды и облучают на γ-облучателе «ИПК» ( 137 Сs) общей дозой 2500 рад (мощность дозы 500 рад/мин, время облучения 5 мин). В дальнейшем облученные взвеси рекомендуется держать на льду. При отсутствии облучателя взвеси следует обработать митомицином С из расчета 25 мкг на 1 мл и инкубировать 40 мин при +37°С. После инкубации клетки стимулирующей популяции отмывают в среде 199 три раза в течение 20 мин и осаждают при 1500 об./мин. Отмытые таким образом лимфоциты ресуспендируют в среде 199, содержащей 30% фетальной телячьей сыворотки, доводя концентрацию клеток до 1 · 10 7 в 1 мл. Клетки отвечающей (ОП) и стимулирующей популяции (СП) смешивают, добавляя к 0,8 мл ОП (1 · 10 6 лимфоцитов) 0,2 мл СП (2-10 6 лимфоцитов), инкубируют в течение 120 ч при 37°С в атмосфере 5% СО2.
По истечении указанного срока максимально удаляют надосадочную жидкость, из осадка готовят мазки, фиксируют в метаноле 15 мин и красят по Романовскому азур-эозином. Подсчет клеток производят при увеличении 10×90, считают 500 клеток и определяют процент бластов, учитывая следующие клеточные формы: неизмененные лимфоциты, лимфоциты с признаками трансформации в бласты, макрофаги и собственно бласты. Отрицательным считают результат, когда в культуре содержится не более 15% лимфоцитов с признаками трансформации в бласты.
Более совершенным способом учета результатов является использование радиационной метки. Для этого после инкубации в культуру добавляют 1 мкл 3 Н-тимидина, с активностью 40 кБк, и помещают на 6 ч в СО2-инкубатор. Затем приостанавливают включение тимидина, для чего смесь лимфоцитов охлаждают в холодильнике при +4°С или в ванночке со льдом. Сбор клеток на фильтры, отмывание клеток физиологическим раствором, трихлоруксусной кислотой (ТХУК) и 96% этанолом выполняется автоматически с помощью аппарата «клеточный харвестер». При этом на фильтры переносятся комплексы ДНК-ТХУК. Все миллипоровые фильтры с комплексами ДНК-ТХУК помещают во флакончики с 5 мл сцинтиляционной жидкости. Регистрация результатов радиоактивности проб осуществляется на β-счетчике в течение 1 мин. Полученные результаты позволяют высчитать индекс стимуляции (ИС), представляющий собой частное от деления величины синтеза ДНК лимфоцитами (имп./мин) при стимуляции их аллогенными лимфоцитами на величину синтеза ДНК этими же лимфоцитами при стимуляции их аутологичными лимфоцитами.
Полученные результаты позволяют сделать заключение о совместимости или несовместимости реципиента по HLA-D. При совместимости реципиента и донора по HLA-D индекс стимуляции лимфоцитов реципиента лимфоцитами донора и индекс стимуляции лимфоцитов донора лимфоцитами реципиента должны быть близки к единице. При этом индексы стимуляции лимфоцитов реципиента и донора лимфоцитами третьего партнера должны в несколько раз превышать единицу. При слабой реакции лимфоцитов реципиента на лимфоциты третьего партнера (например, вследствие иммунодепрессивного состояния) низкий пролиферативный ответ лимфоцитов реципиента на лимфоциты донора не может рассматриваться как результат идентичности антигенов HLA-D.
Ход определения: исследуемые сыворотки крови больных помещают в камеры Терасаки под слой вазелинового масла по 1 мкл, заполняя по 3 лунки каждым сывороточным образцом. Из крови доноров выделяют взвесь лимфоцитов на градиенте плотности фиколл-верографин (1,077 г/см 3 ) и после двухкратного отмывания доводят концентрацию лимфоцитов до 2 х 10 6 /мл. Полученную взвесь донорских лимфоцитов вносят под слой вазелинового масла по 1 мкл и смешивают с исследуемыми сыворотками. Смесь инкубируют при +20°С 60 минут, после чего вносят в лунки по 4 мкл кроличьего комплемента и продолжают инкубацию в течение 1 ч. По окончании инкубации добавляют 1 мкл 5% раствора эозина и через 5 мин останавливают реакцию добавлением 4 мкл 17% раствора формальдегида. Учет реакции проводят непосредственно в лунках камеры Терасаки при микроскопировании лимфоцитов (увеличение 10×7 или 10×15).
Примечание: в качестве отрицательного контроля используют сыворотку донора АВ (IV) группы, инактивированную прогреванием при +56°С. Положительным контролем может служить антилимфоцитарный глобулин.
Сыворотку больного инактивируют при +56°С 30 мин. В микропробирку вносят (по 10 мкл сыворотки больного, цельной и разведенной 1:2 и по 10 мкл лейкоцитов донора. Инкубируют 1 ч при 37°С. По окончании инкубации добавляют 10 мкл 1% раствора уксусной кислоты и через несколько минут микроскопируют.
Примечание: в качестве контроля используется инактивированная сыворотка донора АВ(IV) группы.
ИСЛЕДОВАНИЕ АНТИГЕНОВ ТРОМБОЦИТОВ
Реакция связывания комплемента с тромбоцитами (микровариант)
Тромбоциты, выдержанные при температуре 4-6°С в течение 24-48 ч, дают более отчетливые результаты по сравнению со свежевыделенными.
Приготовление взвеси эритроцитов барана
Дефибринированную кровь барана асептически консервируют раствором Олсвера в соотношении 1:1, разливают по 0,5 мл в пробирки и хранят при + 4°С в течение недели до использования. Кровь пригодна для постановки реакции в течение 4-6 недель, если при отмывании эритроцитов отсутствует гемолиз в надосадочной жидкости. Эритроциты перед использованием в реакции отмывают дважды физиологическим раствором и однокрaтно ВБР.
Приготовление гемолитической системы. Эритроциты бaрана после отмывания ресуспендируют в ВБР; для использования в реакции готовят 2% взвесь эритроцитов (4x 10 5 клеток в 1 мм 3 ).
Для приготовления индикаторной гемолитической системы сенсибилизируют 2% взвесь бараньих эритроцитов путем инкубации в течение 30 мин при температуре +37°С с соответствующим объемом гемолитической сыворотки, разведенной по титру забуференным физиологическим раствором. В реакции используется кроличья гемолитическая сыворотка. Сенсибилизированные бараньи эритроциты хранят при +4 С: их можно использовать в течение 24-48 ч.
Для постановки реакции необходимо определить титр комплемента и минимальную гемолитическую единицу гемолитической сыворотки. Это устанавливается предварительным титрованием. Можно одновременно производить титрование гемолитической сыворотки и комплемента в микрокамерах.
Способ приготовления ВБР: 85,0 г хлорида натрия, 3,75 г натрия 5,5-диэтилбарбитурата растворяют в 140 мл дистиллированной воды; 5,75 г 5,5% диэтилбарбитуровой кислоты растворяют в 500 мл горячей дистиллированной воды, после чего оба раствора смешивают, охлаждают, добавляют 5 мл 1 М раствора хлорида магния и 0,3 г хлорида кальция, доводят объем до 2000 мл дистиллированной водой. Сохраняют раствор при +4°С. Перед использованием этот раствор смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1:4.
Ход реакции связывания комплемента в микромодификации. Инактивированные путем прогревания при температуре +56°С в течение 30 мин сыворотки распределяют по лункам микрокамеры в объеме 2 мкл, к ним добавляют по 2 мкл взвеси тромбоцитов и по 2 мкл комплемента (2 минимальные гемолитические единицы по титру), смесь инкубируют при температуре +37°С в течение 1 ч, после чего добавляют по 2 мкл сенсибилизированных эритроцитов барана (гемолитическая система), инкубацию продолжают в течение 30 мин. На положительный результат реакции указывает полное отсутствие гемолиза (++++) или различные степени его задержки (+, ++, +++).
Полный гемолиз бараньих эритроцитов свидетельствует об отрицательном результате реакции. Для пояснения приводим схему постановки реакции (табл. 18.20 [показать] ).
| Таблица 18.20. Схема постановки связывания комплемента с тромбоцитами (дозы ингредиентов указаны в мкл) | ||||
| Ингредиенты | Тест | Контроль | ||
| на антикомплементарность | активности комплемента | |||
| сыворотки | тромбоцитов | |||
| ВБР | — | 0,2 | 0,2 | 0,4 |
| Суспензия тромбоцитов | 0,002 | — | 0,2 | — |
| Разведения сыворотки | 0,2 | 0,2 | — | — |
| Комплемент | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
| Смешивают, инкубируют 1 ч при 37°С | ||||
| Гемолитическая система | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
| Инкубируют 0,5 ч при 37°С | ||||
Достоверность полученных результатов подтверждается постановкой соответствующих контрольных исследований. При правильной постановке реакции во всех контролях должен быть полный гемолиз.
Для выявления взаимодействия между антигенами Gm и Inv и антисыворотками, направленными к ним, применяется «индикаторная система», представляющая собой резусположительные эритроциты группы 0(1) с фиксированными на них анти-D иммуноглобулинами с определенным Gm- или Inv- антигенным составом.
Индикаторная система готовится следующим образом: к 0,6 мл 50% взвеси трижды отмытых эритроцитов добавляют 0,6 мл 0,9% раствора хлорида натрия и 0,6 мл сыворотки анти-D. Смесь инкубируют в термостате при температуре +37°С в течение 1,5 ч, после чего эритроциты отмывают от избытка анти-D сыворотки 0,9% раствором хлорида натрия и в этом же растворе готовят 2% взвесь сенсибилизированных эритроцитов. Приготовленная взвесь пригодна для работы в течение 48 ч.
Для исследования антигенов системы Gm и Inv используют микровариант реакции подавления гемагглютинации. В каждую лунку камеры Терасаки помещают 2 мкл стандартной сыворотки соответствующей анти-Огп или анти-Inv принадлежности и 2 мкл исследуемой сыворотки, разведенной 1:4 физиологическим раствором. Содержимое лунки перемешивают легким покачиванием. Камеру оставляют при комнатной температуре в течение 10-15 минут, а затем в каждую лунку добавляют по 4 мкл 2% взвеси сенсибилизированных эритроцитов, после чего камеру помещают в холодильник (4-5°С) в на 30-40 мин.
Результаты реакции оценивают макроскопически при положении камеры под углом 45°.
Если иммуноглобулины исследуемой сыворотки содержат антиген Gm или Inv, то они взаимодействуют со стандартной антисывороткой (анти-Gm или анти-Inv) и нейтрализуют ее, в результате чего сенсибилизированные эритроциты остаются неагглютинированными, и их осадок формирует на дне и стенках лунки камеры Терасаки полоску с ровными краями. В случае отсутствия в иммуноглобулинах исследуемой сыворотки указанных антигенов, стандартные сыворотки анти-Gm и анти-Inv сохраняют специфическую активность и реагируют с антигенами иммуноглобулинов, фиксированных на эритроцитах, вызывая агглютинацию последних. Агглютинированные эритроциты формируют плотный осадок с фестончатыми краями на дне лунки камеры.
Ложные результаты могут быть обусловлены бактериальным загрязнением исследуемой сыворотки, недостаточной активностью стандартных анти-Gm или анти-Inv сывороток.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИТРОМБОЦИТАРНЫХ АНТИТЕЛ
Перекрестная проба в тесте тромбоцитоагглютинации
Трактовка результатов. Наличие средних и крупных (более 20 пластинок) агглютинатов свидетельствует о наличии тромбоагглютининов в исследуемой сыворотке.
| Страница 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 | всего страниц: 10 |
Источник: Медицинская лабораторная диагностика, программы и алгоритмы. Под ред. проф. Карпищенко А.И., СПб, Интермедика, 2001