Ros1 негативная что это
Транслокации с участием гена ROS1
Тестирование на наличие транслокации гена ROS1
Онкоген ROS1 кодирует рецепторную тирозинкиназу, родственную киназе анапластической лимфомы (ALK) [16], а также ряду членов семейства инсулиновых рецепторов. ALK и ROS1 отвечают за синтез взаимосвязанных тирозинкиназ, АТФ-связывающие домены которых на 77% идентичны по аминокислотному составу (рис. 1).
Рисунок 1. Родственные киназы ALK и ROS1.
Реаранжировка приводит к слиянию части ROS1, которая включает полный домен тирозинкиназы, с 1 из 12 различных белков-партнеров.
Полученная в результате слияния тирозинкиназа ROS1 активируются конститутивно и обуславливает клеточную трансформацию.
Зачем определять статус транслокации ROS1?
Обнаружение транслокации ROS1 при немелкоклеточном раке легкого принципиально для проведения терапии таргетным препаратом кризотиниб, являющимся единственным зарегистрированным ингибитором тирозинкиназы ROS1.
Кому нужно проводить тестирование?
Реаранжировки ROS1 развиваются примерно у 1-2% пациентов с НМРЛ. Как и реаранжировки ALK, реаранжировки ROS1 чаще выявляются у пациентов, которые никогда не курили или у которых в анамнезе имеется курение в небольших количествах, и отмечаются гистологические признаки аденокарциномы.
Методы диагностики
Методика диагностики реаранжировки ROS1 полностью соответствует алгоритму выявления реаранжировки ALK и на сегодняшний день производится с использованием метода FISH, ИГХ и OТ-ПЦР. Важно помнить, что на генетическом уровне реаранжировки ALK и ROS1 редко развиваются в одной и той же опухоли, и каждая из них определяет уникальную подгруппу НМРЛ [21].
В рамках Программы алгоритм диагностики по выявлению транслокации ALK и ROS1 у пациентов с немелкоклеточным раком легкого представлен на рис. 2.
Рисунок 2. Алгоритм тестирования.
Для того, чтобы отправить материал на диагностику, вы должны быть зарегистрированным пользователем. Если у вас уже есть логин и пароль, то повторная регистрация не требуется.
Если вы новый пользователь, пожалуйста, пройдите процедуру регистрации.
Ros1 негативная что это
Исследование, которое проводится для выявления в клетках опухоли специфического белка. Этот белок будет экспрессироваться при наличии мутировавшего гена. Исследуют гистологический препарат биопсийного материала рака при помощи антител с флюоресцентной меткой.
Определение транслокации гена ROS1 (иммуногистохимический анализ).
ROS1 gene, Proto-oncogene tyrosine-protein kinase ROS, ROS1 genetic rearrangements.
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Образец ткани, образец ткани в парафиновом блоке.
Общая информация об исследовании
ROS1 – это ген, производящий белок под названием ROS1, который участвует в передаче сигналов в клетках, в росте клеток и их дифференциации. Мутированные формы гена ROS1 были обнаружены при некоторых типах рака, включая немелкоклеточный рак легких, глиобластому головного мозга, рак желчного протока, яичника, желудка, толстой и прямой кишки.
При немелкоклеточном раке легких частота обнаружения мутации в гене ROS1 составляет 1,7-2 %.
Транслокацию гена ROS1 чаще находят у некурящих пациентов или тех, кто курил мало. При этом у них при гистологическом исследовании подтверждается аденокарцинома.
Открытие молекулярных подтипов немелкоклеточного рака легкого с онкогенными мутациями и транслокациями/перестройками привело к успешной разработке таргетной терапии и улучшению исходов у пациентов с прогрессирующим раком легкого.
Действие таргетных препаратов при раке легкого направлено на различные рецепторные тирозинкиназы, участвующие в росте и развитии злокачественных опухолей. Плюсом таргетной терапии является то, что действие препарата направлено непосредственно на опухолевые клетки и не вызывает сильной токсичности для всего организма. При этом эффективность лечения высока.
Пациентам с немелкоклеточным раком легких, у которых выявлена перестройка гена ROS1, рекомендована терапия кризотинибом, который является мультитаргетным низкомолекулярным ингибитором тирозинкиназ рецепторов ALK, MET и ROS1.
Для чего используется исследование?
Когда назначается исследование?
Что означают результаты?
Определяется ROS 1-статус опухоли (позитивный/негативный).
При обнаружении перестройки гена ROS1 у пациентов с немелкоклеточным раком легких показано назначение таргетной терапии кризотинибом.
Является ли рак легких ROS1-негативным?
Препараты, такие как crizotinib, используются для лечения пациентов с ROS1-положительным раком легких. Но какие пациенты являются ROS1-положительными? Исследовательский центр Университета Колорадо, опубликовал в Журнале торакальной онкологии общие лабораторные тесты, используемые для определения статуса ROS1, которые имеют неотъемлемые ограничения, которые могут привести к ложноотрицательным результатам. Было показано, что некоторые образцы, которые были определены как ROS1-отрицательные на один тест, были ROS1-положительными на другой, а это означает, что некоторые пациенты, которые могут получить пользу от ROS1-направленной терапии, могут не получить нужное лечение.
Общепринятый тест, основанный на методе, известном как гибридизация флуоресценции (FISH), дал ложный отрицательный результат для 2 из 20 образцов, известных как ROS1-положительный.
Дэвис, первый автор исследования, тесно сотрудничал с коллегами, в том числе старшими авторами Робертом К. Доебелем, доктором медицинских наук, директором Инициативы по исследованиям торакальной онкологии в Центре рака, и Дарой Айснер, доктор медицины, доктор философии, директор CMOCO в Департаменте патологии CU, который регулярно использует несколько способов тестирования образцов рака.
Исследование показало, что каждый тест имеет присущие ему недостатки. ROS1-позитивные раковые заболевания вызваны слиянием гена ROS1 с одним из нескольких генов-партнеров. Один из этих возможных партнеров находится очень близко к ROS1 на хромосоме 6. Когда ROS1 сливается с этим ближайшим партнером, может быть недостаточно ДНК, удаленной для идентификации слияния с использованием FISH.
Недостаток теста на основе ДНК был обусловлен неспособностью правильно упорядочить большие участки гена ROS1.
В отличие от двух других тестов, анализ на основе РНК не пытается сделать снимок измененной ДНК ROS1. Вместо этого он смотрит на то, что производится из ДНК. Это означает, что анализ на основе РНК имеет потенциал для более прямого тестирования результатов синтеза генов ROS1, которые могут приводить к раку.
С положительной стороны, патологи, рассматривающие данные анализа, могут определить, обладает ли РНК достаточно высоким качеством, чтобы верить результатам теста. В этих случаях можно использовать тест FISH или ДНК.
Нет идеального теста, и иногда для подтверждения результатов необходим вторичный анализ.
Определение перестройки гена ROS1 (ИГХ)
Что такое ROS1
ROS1 является протоонкогеном*, кодирующим одноименный рецепторный белок, обладающий тирозинкиназной активностью, в частности было показано что данный белок может обладать рецепторной активностью для факторово роста и дифференцировки клеток.
Роль ROS1 в онкологии.
Как и в случае с протоонкогеном ALK1 в некоторых случаях, при мутациях ROS1 (преимущественно транслокации) происходит его трансформация в онкоген**, приводящее к повышенному синтезу “неправильного” рецепторного белка с какоплением его в опухолевых клетках и, как результат, к неконтролируемому клеточному росту и подавлению запрограммированной клеточной смерти (апоптоза). Таким образом опухолевая клетка становится бессмертной.
При каких патологиях исследуют статус ROS1
Мутации в гене ROS1 с избыточной гиперэкспрессией одноименного белка наблюдается в большом количестве эпителиальных опухолей взрослых и детей:
Наибольшее количество исследований проводится в группе пациентов с аденокарциномой легкого, где частота мутаций данного гена составляет около 1-2%. Интересным фактом является то, что мутации данного гена наблюдаются преимущественно у пациентов молодого возраста (до 50 лет), с азиатскими корнями, без анамнеза отягченного курением.
Более того, в последнее время усиленно изучается роль данного гена и возможность использования таргетной терапии в неэпителиальных опухолях:
Цель и методы определения мутаций в гене ROS1.
Как и в случае с другими протоонкогенами (ALK1, KRAS, EGFR), основной целью исследования статуса данного гена является возможность назначения таргетной терапии препаратами ингибиторами ROS1 (наиболее распространен Кризотиниб). На этапе скрининга рекомендуется исследовать наличие патологического белка ROS1 методом иммуногистохимии во всех случаях немелкоклеточного рака легкого (независимо от возраста, пола, анамнеза). Данный метод является быстрым, недорогостоящим, обладает высокой чувствительностью и относительно высокой специфичностью. При обнаружении в опухолевых клетках патологического белка, окончательное наличие мутации должно быть подтверждено молекулярными методами (FISH, RT-PCR, NGS).
Как происходит исследование.
Требуется предоставить биопсийный, операционный материал или парафиновый блок содержащий опухолевую ткань в лабораторию UNIM, где он будет исследован методом иммуногистохимии, а результаты будут оценены компетентным специалистом.
Возможно предоставление также и цитологического материала в виде взвеси клеток (жидкостная цитология, плевральные, перитонеальные выпоты) из которых изготавливается клеточный блок.
При положительном результате исследования (обнаружении экспрессии белка), все тот же специалист оценит качество ткани и возможность проведения молекулярного исследования для подтверждения мутации.
Следует отметить что в случае с немелкоклеточным раком легкого исследование ROS1 является частью более широкой панели, включающей также исследование ALK1 (методом ИГХ) и EGFR (методом ПЦР).
*Протоонкогеном является ген, который контролирует различные функции в клетке, но в ходе мутаций превращается в онкоген.
**Онкогеном является ген, при активации которого происходит неконтролируемое деление клеток.
По всем возникшим вопросам Вы можете проконсультироваться у нашего медицинского администратора по телефону: 8-800-555-92-67 или написать нам в WhatsApp: +7 925 740 05 87
ALK и ROS1 в качестве целевых терапевтических парадигм и клинических последствий для преодоления резистентности к кризотинибу
В течение последнего десятилетия более 10 целевых генов онкогенных генов были подтверждены в немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ). Анапластическая лимфомакиназа (ALK) и киназа ROS1 представляют собой два новых гена-водителя, участвующих в ALK- и ROS1-перестроенном НМРЛ. Сообщалось, что ингибирование ALK и ROS1 с помощью кризотиниба является высокоэффективным и хорошо переносимым у этих пациентов. Тем не менее, резистентность к кризотинибу возникает спустя годы после лечения, и предпринимаются все более активные усилия для преодоления этой проблемы. Здесь мы рассмотрим биологию ALK и ROS1 и их роли в развитии рака. Мы также суммируем текущие и завершенные клинические испытания, подтверждающие, что ALK и ROS1 являются мишенями для лечения рака. В последнем разделе обзора мы обсудим молекулярные механизмы резистентности кризотиниба и фокусные подходы к его преодолению. Этот обзор описывает захватывающую новую область исследований и может дать новые идеи для целенаправленной терапии рака.
Открытие гибридного гена 4-анапластической лимфомы киназы (EML4-ALK) в трансмутирующем микроканале (EML4-ALK) при раке легкого в 2007 году показало, что ALK является не только геном-драйвером для очень редких видов гематологического рака, но также может служить терапевтическая мишень для немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) 1. АЛК присутствует примерно у 3% до 5% пациентов с НМРЛ, в США ежегодно посещает около 8 000 пациентов [5]. Через пару месяцев после отчета о перегруппировке ALK в НМРЛ ученые обнаружили перегруппировку онкогена ROS1 в НМРЛ [6]. Crizotinib (PF02341066) представляет собой многоцелевой ингибитор тирозинкиназы с высокой клинической эффективностью у пациентов с НМРЛ, несущих перегруппировки ALK и ROS1 [7, 8]. В свете его высокой эффективности и безопасности в клинических испытаниях фазы I и фазы II, кризотиниб получил ускоренное одобрение Управления по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) в качестве передовое лечение для продвинутого ALK-перестроенного НМРЛ.
Несмотря на быстрые и драматические эффекты, общей проблемой целенаправленной терапии является развитие резистентности. В случае ALK- и ROS1-перестроенного НМРЛ, устойчивость к кризитинибу неизбежно возникает в течение многих лет лечения [9]. Аналогично резистентности к ингибиторам рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), резистентность к кризотинибу часто возникает в результате резистентных мутаций внутри доменов тирозинкиназы ALK и ROS1 [10]. Доклинические исследования с использованием линий клеток, полученных из пациентов, показали, что активация сигнализации обходной тирозинкиназы способствует резистентности к кризотинибу [11]. Здесь мы рассмотрим открытие и биологию онкогенной перегруппировки ALK и ROS1 и суммируем несколько основных клинических испытаний, которые подтвердили кризотиниб в качестве терапевтического агента для НМРЛ. Мы также сосредоточим внимание на установленных и текущих исследованиях по устойчивости к кризотинибу. Наконец, мы обсудим несколько перспективных стратегий мониторинга и лечения пациентов с НМРЛ в клинике после отказа от лечения кризотинибом.
ALK является высококонсервативной рецепторной тирозинкиназой (RTK) и относится к надсемейству рецепторов инсулина. Как и другие RTK, ALK находится в клеточной мембране и состоит из внеклеточного лигандсвязывающего домена, трансмембранного домена и внутриклеточного домена тирозинкиназы. При связывании с лигандами (например, плейотрофином и мидкином) ALK образует гомодимер, который позволяет активировать фосфорилирование ALK и активацию протеинкиназы [12, 13]. Передача сигналов ALK была вовлечена в развитие центральной нервной системы, и ее экспрессия значительно уменьшилась после рождения, за исключением редких рассеянных нервных клеток, эндотелиальных клеток и перицитов в головном мозге, что указывает на характер распределения нервной системы ALK в физиологических условиях [14 ]. Тем не менее, различные изменения в гене ALK, такие как мутации, сверхэкспрессия, амплификация, транслокация или другие структурные перегруппировки, были вовлечены в опухолевый генез рака человека [15]. Нейробластома — это педиатрический рак, который обладает аномалиями ALK, которые возникают из-за усиления гена и активации мутаций [16, 17]. Чен и его коллеги сообщили, что амплификация ALK вместе с амплификацией MYCN способствует опухолегенезу нейробластомы. Последовательность ДНК дополнительно выявила восемь мутаций AMK missense в 13 из 215 вырезанных опухолей и 8 из 24 клеточных линий, полученных из нейробластомы. Эти мутации генерируют семь различных аминокислотных замен в пяти разных положениях [18]. Мутантный ALK подвергается аутофосфорилированию и имеет повышенную активность киназы (это известно как мутация, активирующая киназу) по сравнению с ALK дикого типа. Таким образом, ожидается, что нацеливание на активирующее киназу мутантное ALK с использованием молекулярного подхода улучшит клинические исходы продвинутой ALK-мутантной нейробластомы [19]. В дополнение к нейробластоме, ALK амплификация и мутация сообщаются при других типах рака, включая рак пищевода, воспалительный рак молочной железы, колоректальный рак и рабдомиосаркома 22.
Тем не менее, наиболее доминирующие геномные изменения ALK в раке вызваны хромосомной перегруппировкой, когда различные партнеры по слиянию и связанные с ними промоторные области сливаются с вышерасположенным доменом ALK-киназы, что приводит к конститутивной активации ALK и нижерасположенных путей PI3K / Akt и MAPK / Erk. Первая перегруппировка ALK была описана в 1994 году в анапластической крупноклеточной лимфоме (ALCL), как и в (2; 5) (p23; q35) перегруппировке, которая сжигает ALK от хромосомы 2 до нуклеофосмина (NPM) из хромосомы 5. Слитый ген NPM-ALK состоит из первых четырех экзонов NPM и экзонов, кодирующих весь домен тирозинкиназы ALK, и он присутствует более чем у 50% пациентов с ALCL [1]. Также были обнаружены другие схемы слияния ALK, такие как тропомиозин 3 (TPM3), TRK-конденсированный ген (TFG) и тропомиозин 4 (TPM4). Однако перегруппировка ALK в NSCLC не была обнаружена до 2007 года исследовательской группой Хироюки Мано в Японии [4]. Мано и его коллеги создали библиотеку кДНК у пациента с аденокарциномой легкого и идентифицировали гены слияния, состоящие из внутриклеточного домена тирозинкиназы ALK и EML4, было показано, что этот слитый ген имеет онкогенную активность в мышиных клетках 3T3 и голых мышах. Кроме того, мутант EML4-ALK K589M без активности киназы не был способен к опухолегенезу. Лечение ингибитором тирозинкиназы ALK WHI-P154 заметно ингибировало рост EML4-ALK-трансформированных клеток Ba / F3 [4]. Онкогенный потенциал EML4-ALK in vivo был дополнительно выделен группой Mano. В отличие от трансгенетических моделей мыши, управляемых другими онкогенами, которые обычно развивают опухоли примерно через 3-6 месяцев после рождения, у трансгенетических мышей с легким специфическим EML4-ALK развиваются множественные узлы рака легких в обоих легких без латентности после рождения, а ингибирование ALK приводит к к резкой регрессии опухоли in vivo. [24]. Недавнее исследование с использованием CRISPR / Cas9-опосредованной инженерии EML4-ALK in vivo у мышей также показало, что мыши, экспрессирующие EML4-ALK, родились с раком легких, что указывает на то, что EML4-ALK определенно является сильным промотором рака и хорошей терапевтической мишенью [25 ].
В дополнение к EML4-ALK, другие шаблоны слияния, которые были идентифицированы, включают KIF5B-ALK, KLC1-ALK и TFG-ALK, а наиболее распространенным шаблоном слияния является EML4-ALK (таблица 1). В зависимости от доли гена EML4, слитого с ALK, было идентифицировано более девяти вариантов EML4-ALK, и все эти варианты ALK показывают замечательный ответ на ингибиторы тирозинкиназы ALK in vitro и in vivo [26, 27] (Рис. 1А). Поэтому киназная функция ALK имеет решающее значение для трансформации клеток, а слитые белки ALK являются терапевтическими мишенями для НМРЛ (обсуждается ниже).
A. Слитый белок EML4-ALK варианта 1 конститутивно активирует сигналы PI3K / Akt, MAPK / Erk и Jak / Stat, что способствует пролиферации клеток, выживанию и опухолегенезу. B. Ингибитор ALK crizotinib ингибирует киназную активность варианта EML4-ALK 1 и впоследствии отменяет сигналы PI3K / Akt, MAPK / Erk и Jak / Stat ниже по течению, что приводит к апоптозу и смерти раковых клеток.
Другое суперсемейство рецепторов инсулина, RTK ROS1 (хромосома 6q22), определяет уникальное молекулярное подмножество NSCLC. К сожалению, очень мало известно о функции ROS1 дикого типа. Мыши, не имеющие ROS1, кажутся здоровыми, хотя у мужчин наблюдаются аномалии в эпидидимисе, которые предотвращают нормальное размножение [28]. Лиганды для ROS1 еще не идентифицированы [29]. Соматические мутации ROS1 и фокальное усиление сообщалось на очень низкой частоте при раке, и значимость этих генетических изменений в значительной степени неизвестна. Первый слитый белок ROS1 был обнаружен в клеточной линии глиобластомы U118MG. Слитый ген был образован делецией в хромосоме 6, которая привела к слиянию 3′-области ROS1 с 5′-областью на фиг. (Таблица 1). Экспрессия слитого белка FIG-ROS1 приводит к независимому от фиксации росту, образованию фокусов и опухолегенности [30, 31]. Кроме того, FIG-ROS1, SLC34A2-ROS1, CD74-ROS1, EZR-ROS1, TPM3-ROS1 и SDC4-ROS1 и родственные варианты распознаются как новые гены драйвера рака и связаны с чувствительностью к ингибированию ROS1 32 ( Таблица 1). По оценкам, приблизительно 1% НМРЛ поддерживает перегруппировку ROS1 [35]. Интересно, что недавнее биохимическое исследование показало, что ROS1-белки разделяют гомологию аминокислотных последовательностей на 77% с ALK в сайтах связывания АТФ домена тирозинкиназы; это приводит к наблюдению, что ингибиторы ALK crizotinib и TAE684 глубоко ингибируют активность ROS1-киназы и приводят к регрессии опухоли [36]. Было показано, что ингибитор EGFR-гефитиниб сенсибилизирует ингибирование ROS1 в клетках HCC78, которые содержат SLC34A2-ROS1, что указывает на то, что ROS1 может взаимодействовать с EGFR для стимулирования пролиферации в этой клеточной линии [37]. Напротив, перегруппировка ROS1 оказалась взаимоисключающей для перегруппировки ALK в НМРЛ [38]. Хотя в настоящее время в клинических испытаниях не присутствуют ингибиторы ROS1-специфического тирозинкиназы, кризотиниб и другие ингибиторы ALK могут также иметь активность против ROS1. Недавно Pfizer объявил, что кризотиниб получил прорывную терапию от FDA для потенциального лечения ROS1-перестроенного НМРЛ.
ALK и ROS1 обнаруживаются примерно у 5% и 1% пациентов с НМРЛ, соответственно, что составляет большое количество пациентов во всем мире. Флуоресценция in situ гибридизации (FISH) с разрыхляющими зондами в настоящее время является наиболее эффективной диагностической технологией для обнаружения хромосомной перегруппировки, и она была одобрена для обнаружения перегруппировки ALK в клинических условиях [39]. Анализ ПЦР обратной транскриптазы и высокочувствительная иммуногистохимия также применимы для предварительных скрининг-тестов перед FISH [5, 40, 41]. В то время как большая часть образцов биопсии не подходит для приготовления фиксированной формалином, содержащей парафин ткани (FFPE) для этих анализов на выявление, важно отметить различные клинико-патологические особенности пациентов с ALK- и ROS1-перегруппировкой. В отличие от EGFR, распространенность ALK- и ROS1-перегруппировок сходна у кавказцев и азиатов. Эти пациенты, как правило, моложе во время диагноза. Изменения ALK и ROS1 также связаны с тем, чтобы никогда не курить и не иметь историю легкого курения, женский пол и аденокарциному с гистологией клеточных клеток и, по-видимому, взаимоисключающими с другими генами онкогенных генов 44. Тем не менее, недавние исследования показали, что 8% ALSC-перегруппированных НМРЛ также являются положительными либо для активирующей мутации EGFR, либо для k-RAS 46.
Crizotinib, мощный АТФ-конкурентный тирозинкиназный ингибитор тирозинкиназы II типа, который ингибирует ALK, уже одобрен FDA для лечения ALK-перегруппированного НМРЛ. Интересно, что кризотиниб был первоначально разработан для нацеливания прото-онкопротеина c-Met [49]. Анализ скрининга на ингибирование киназы показал, что кризотиниб ингибировал активность фосфорилирования до 13 киназ (c-Met, ALK, RON, Axl, Tie-2, TrkA, TrkB, Abl, IRK, Lck, Sky, VEGFR2 и PDGFRβ) среди 102 киназы. Доклинические модели Met-амплифицированного НМРЛ показали, что добавление кризотиниба приводит к регрессии опухолей ксенотрансплантата 49. Эти результаты привели к клиническим испытаниям у пациентов с Met-амплификациями (NCT01121575). Crizotinib также ингибирует пролиферацию ALK-перегруппированных клеток лимфомы с IC50 приблизительно 50 нМ. В модели ксенотрансплантата с клетками H3122 (клеточная линия NSCLC, положительная для перегруппировки варианта 1 EML4-ALK), лечение кризотинибом приводило к значительной регрессии опухоли [52] (рисунок 1B). В дополнение к crizotinib GSK1838705A, TAE684, CEP-14083, AP26113, ASP3026, NMS-E628 и другие сильные ингибиторы тирозинкиназы, которые могут действовать против онкогенного ALK, все еще находятся в стадии клинического развития [53] (таблица S1).