В чем заключается сущность иммунофлуоресцентного метода диагностики гепатита с
Лабораторная диагностика гепатитов
Лабораторная диагностика гепатитов
К сожалению, не всегда заболевание сразу проявляется клиническими симптомами. Иногда, болезнь длительное время протекает без проявлений. Лабораторные методы необходимо проводить, если пациент находится в группе риска или есть хоть малейшее подозрение наличия гепатита. Чем раньше поставлен диагноз, тем эффективнее лечение.
Лабораторная диагностика гепатита А
Особенности диагностики гепатита В
Клинически гепатит В протекает в 4 периода: инкубационный, период до желтухи, разгар и этап реконвалесценции. Симптомы неспецифические и включают в себя слабость, тошноту, сонливость. Иногда, болезнь начинается с потемнения мочи и обесцвечивания каловых масс. Пациенты жалуются на боль в области печени, зуд кожи, метеоризм. С появлением желтухи состояние становится более тяжелым, нарастает интоксикация, наблюдается сыпь. Болезнь может быть легкой или тяжелой, различают острое, затяжное и хроническое течение.
Особенности диагностики гепатита С
Для диагностики гепатита С применяется метод ИФА. Он показывает наличие специфических антител к различным элементам вируса. С помощью полимеразно-цепной реакции можно обнаружить РНК вируса.
Особенности течения и диагностики гепатита G
Данная группа гепатитов встречается у пациентов после переливания крови, у наркоманов, которые используют инъекционный путь введения веществ, у пациентов, которые проходят гемодиализ.
Гепатит Е- особенности заболевания и его диагностика
Диагностика на стадии клинических проявлений заключается в изучении биохимического анализа. В 5-10 раз увеличиваются показатели трансаминаз. Тимоловая проба не повышается или растет незначительно. Точно установить диагноз гепатита Е возможно после обнаружения в крови антител к вирусу. Обращают внимание на класс IgM, для чего проводят иммуноферментный анализ. Также проводят полимеразно-цепную реакцию, чтобы обнаружить РНК вируса.
Диагностика гепатита, независимо от его вида происходит комплексно: оценивается клиническая картина, данные инструментальных методов. Лабораторные методы играют ключевую роль и постановка диагноза возможна только после их результатов, но другие методики позволяют установить степень тяжести и характер течения.
В динамике, анализ пересдается. Это необходимо, чтобы оценить качество лечения, назначить другую схему препарата или продолжать выбранную тактику.
Как подготовиться к сдаче анализов?
Лабораторная диагностика гепатитов рекомендована пациентам:
Особенной подготовки анализу не требуется. Для диагностики нужна венозная кровь, которую собирают натощак. Желательно исключить из рациона жирную пищу, спиртное и продукты оранжевого цвета, так как они влияют на показатели работы печени. Перед сдачей анализов посоветуйтесь с лечащим врачом на предмет употребления лекарственных средств.
Забор биологического материала для анализа происходит в лабораторных условиях, в медицинском учреждении. Желательно, чтобы в клинике использовались качественные реактивы и современное оборудование, так как это делает результат более точным. На руке затягивается жгут, чтобы ограничить приток крови. Место укола обрабатывается, далее происходит пункция вены и забор крови. Место укола обрабатывают дезинфицирующим средством. Результаты анализа готовы на следующие сутки. Данный метод диагностики применяют в динамике, для оценки качества лечения и назначения новых тактик.
Расшифровка результатов зависит от вида анализа. Он может быть качественным (подтверждает или исключает наличие вируса), а может быть количественным ( говорит о форме болезни, характере течения, эффективности терапии). Результаты исследования оценивает инфекционист.
Отрицательный результат анализа говорит об отсутствии вируса в крови. Еще во время инкубационного периода антиген проявляется в сыворотке, поэтому результаты обладают высокой точностью. Может наблюдаться низкий уровень антител, ниже порогового значения, что также говорит о том, что анализ отрицательный.
Положительный результат требует повторного исследования. Высокий уровень антител может наблюдаться после недавней острой формы со стертыми симптомами. Также, антитела говорят об острой или хронической форме болезни, носительстве. На основе специфического и неспецифических методов диагностики назначается лечение и проводится его контроль.
Лаборатория АО «СЗЦДМ» предлагает услуги, обеспечивающие комплексное и преемственное лабораторное обследование пациента
Диагностика В медицинских центрах АО «СЗЦДМ» проводят качественные диагностические исследования всего организма
Лечение Наши медицинские центры ориентированы на обслуживание пациентов в амбулаторном режиме и объединены единым подходом к обследованию и лечению пациентов.
Иммунофлуоресцентный анализ
Для определения качественного либо количественного состава антигенов (поверхностных или внутриклеточных) современные лаборатории используют ИФА (иммунофлуоресцентный анализ). Это целый комплекс лабораторных тестов, которые также могут называться методом флуоресцирующих антител (МФА).
Что это такое
Метод разработан в 40 годах прошлого века, в его основе лежит принцип флуоресценции, кратковременного подсвечивания определенных молекул. Суть иммунофлуоресцентного метода – это выявление антигенов за счет специфических антител, образующих с ними связи, имеющие флуоресцентные маркеры.
Для чего проводится ИФА, что выявляет
Проведение иммунофлуоресцентного анализа, либоМФА (метода флуоресцирующих антител) показано при ранней диагностике и для контроля лечения онкологических заболеваний, особенно – онкогематологии. ИФА проводится при выявлении инфекционных заболеваний (выявление ВИЧ, цитомегалии, герпесной инфекции), наследственных заболеваний, инфекций, передаваемых при половых контактах (уреаплазмы, хламидии). Метод полезен при обнаружении бактерий, которые плохо растут на питательных средах (например, легионеллы, провоцирующие пнеымонии).
Как проводится анализ?
Материалом для исследования служат суспензии клеток бактерий, микоплазм, вирусов и пораженных ими клеток. Также исследуют образцы крови, костного мозга, тонкие тканевые срезы или смывы с бронхов, альвеол. Выделяется два типа исследования:
Прямой ИФА с добавлением раствора антител, помеченных флуоресцентным красителем, непосредственно в исследуемый образец. Образование комплексов антиген-антитело определяется по разному типу и интенсивности свечения.
Непрямой ИФА – в исследуемый образец добавляются антитела первого порядка, а затем – второго, которые проявляют активность первых. Именно добавление вторых антител дает флуоресцентное свечение. Это необходимо для предотвращения неспецифических реакций и ложных результатов.
В нашей клинике можно провести такой анализ по направлению специалиста. Опытные врачи-лаборанты проведут анализ быстро и точно во всех 4 клиниках в городе.
Лабораторная диагностика гепатита C
М.И.Михайлов, Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН, Москва
При постановке диагноза «гепатит С» необходимо учитывать следующие наиболее важные факторы:
Основой лабораторной диагностики гепатита С служат знания о ВГС, его репликации, информация о динамике появления и исчезновения маркеров инфицирования, а также современные иммунохимические и молекулярно-биологические методы детекции антигенов, антител и нуклеиновых кислот.
ВИРУС ГЕПАТИТА С. ВГС впервые был идентифицирован в 1988 году, когда группа исследователей во главе с М. Houghton и Choo Q.L, применив новые молекулярнобиологические методы исследования, клонировала и секвинировала геном вируса [I]. Частица вируса гепатита С имеет сферическую форму со средним диаметром около 50 нм [2,3]. Попытки визуального обнаружения и изучения строения вируса гепатита С предпринимались с момента открытия вируса, однако до сих пор отсутствуют хорошо документированные результаты этих исследований, что, возможно, связано с трудностями накопления вирусных частиц в необходимых количествах.
ВГСединственный член рода Hepacivirus в семействе Flaviviridae, в которое входят такие вирусы, как вирус диареи быков и лихорадки свиней (род Pestivirus) и вирус желтой лихорадки, вирус дэнге и GB-вирусы: GBV-A, GBV-B и GBV-C/HGV (род Flavivi-rus). Схема строения вируса гепатита С может быть представлена следующим образом (схема № 1). Нуклеокапсид содержит РНК вируса гепатита С. Сверху нуклеокапсид покрыт липидной оболочкой с утопленными в ней оболочечными белками, кодированными РНК ВГС. Геном вируса представлен однонитевой линейной молекулой РНК положительной полярности, протяженностью около 9600 нуклеотидов. Организация генома ВГС подобна другим флавивирусам. В нем выделяют две зоны, кодирующие структурные и неструктурные (функциональные) белки. Гены, кодирующие структурные белки, расположены у 5′ области генома вируса, а неструктурные у 3′ области. Ген ВГС имеет одну открытую рамку считывания (ОРС), единый полипептид (приблизительно в 3000 аминокислот), который под действием вирусных и клеточных протеаз нарезается на структурные и неструктурные белки.
Рис. 1. Структурные элементы HCV 
В настоящее время определено 6 основных генотипов и свыше 100 субтипов ВГС. Генотипы 1а, 1в, 2а, 2в, 2с и За составляют более 90% HCV-изолятов, полученных в Северной и Южной Америке, Европе, России, Китае, Японии и Австралии/Новой Зеландии [5]. Генотипы 4, 5а и 6 соответственно регистрируются в Центральной и Южной Африке, Юго-Восточной Азии. В России и странах СНГ зарегистрировано преобладание генотипа 16 (не менее 68,9%) [6,7]. Считается, что пациенты, инфицированные генотипом 1 (особенно 1в), отвечают хуже на лечение по сравнению с пациентами, инфицированными другими генотипами вируса.
У больного ВГС циркулирует как популяция частиц вируса, у которых геномы отличаются друг от друга на 1-2% (квазиспецифичности) в результате мутаций, накапливающихся во время инфекции и/или попавших в организм пациента при заражении. Эти мутантные формы могут способствовать более активной репликации или могут помогать вирусу уклоняться от иммунного ответа организма и потенциально влиять на исход острой инфекции, различия в течении заболевания и ответе на интерферонотерапию [8].
Учитывая, что ВГС персистирует в крови больных острым и хроническим гепатитом С одновременно с анти-ВГС, внимание разработчиков диагностических препаратов концентрировалось на создании тест-систем для детекции антител, обеспечивающих максимально полное выявление носителей вируса и максимально ранние сроки диагностики острой инфекции. Многообразие антигенов и антигенных детерминант, кодированных структурной и неструктурной зоной РНК ВГС, определило направление в конструировании диагностических препаратов выбором и аранжировкой олигопептидов, применяемых для их создания. За время, прошедшее с момента открытия ВГС, созданы диагностические системы трех поколений ( таблица 1).
Таблица 1
Диагностические препараты для выявления анти-ВГС [9]
Применяемые пептиды,
зоны РНК ВГС, в которых
они кодированы
% выявления носителей
ВГС
Время первого
выявления
анти-ВГС от
начала желтухи
С22-3 Core
С200 NS3 и NS4
СЗЗс NS3
С 100-3 NS4
С22-3 Core
С200 NS3 и NS4
СЗЗс NS3
Пептид NS5
В настоящее время во всем мире, в том числе и в России, применяются диагностические препараты 3-го поколения. Пептиды, применяемые в диагностических препаратах, получены при помощи рекомбинантной технологии (например, диагностикумы фирм: «Диагностические препараты», г. Нижний Новгород; «Вектор» г. Новосибирск; «Roche»; «Abbott» и др.), или синтетической (000 МЦ «Авиценна» г. Санкт-Петербург; «Organon» и др.). Диагностикумы, в которых одновременно использованы оба вида пептидов, получили обозначения, как препараты 4-го поколения. По своим характеристикам эти препараты не обладают значимыми различиями. Сравнительные испытания, регулярно проводимые МЗ России, продемонстрировали сопоставимую чувствительность диагностических препаратов отечественных и зарубежных производителей.
Разработка и внедрение этих тестов идет параллельно с внедрением скрининговых тестов для выявления анти-ВГС, повторяя принцип расширяющегося спектра использованных пептидов в каждом последующем поколении диагностических препаратов. Так, диагностикум RIBA-III отличается от предыдущего поколения добавлением пептида, кодированного зоной NS5. Принципы, позволяющие подтвердить позитивный результат выявления анти-ВГС, прежде всего включают: возможность (в некоторых случаях) получения более четких результатов ферментативной реакции при взаимодействии с отдельными пептидами, а также применение в диагностикуме расширенного спектра пептидов, которые не используются в скрининговых тестах. Только введение новых пептидов позволяет повысить диагностическую ценность подтверждающих тестов.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИГЕНОВ ВГС. Возможность определения антигенов ВГС привлекала внимание исследователей сразу же после открытия вируса. Принципиальная возможность их тестирования была продемонстрирована К. Krawczynski с соавторами [23], которые иммуногистохимически обнаружили в печеночной ткани антигены ВГС, доказав специфичность иммунофлюоресцентного свечения. Применение поли- и моноклональных антител к различным антигенам ВГС установило наличие ВГС core Ag, антигенов, кодированных NS3 и NS4 зонами РНК ВГС, в ядре и цитоплазме гепатоцитов, у 60-90% больных хроническим ГС [24].Однако дальнейшие исследования продемонстрировали, что антигены ВГС удается обнаружить менее чем в 5% печеночных клеток.
Первые диагностические тест-системы («Ortho Antibody to Core Antigen (Murine Monoclonal) EL1SA Test System» и «Imucheck F-HCV Ag Core Kokusai») для выявления антигена ВГС появились на рынке иммунобиологических препаратов в 1999 году. В качестве цели детекции был избран Core антиген ВГС, который определяют при помощи твердофазного варианта ИФА, сконструированного на основе моноклональных антител. Первые исследования по применению этих тестов определили их высокую чувствительность, специфичность, и перспективность применения, прежде всего, в службе переливания крови [25,26]. Установлены:
Метод гибридизации основан на соединении меченных гибридизационных зондов (генноинженерные или синтетические молекулярные структуры, содержащие в себе нуклеотидные последовательности, комплементарные избранным участкам РНК). Учет результатов осуществляют по интенсивности сигнала, поступающего от метки в составе образовавшегося комплекса.
Метод гибридизации, применяемый для детекции РНК ВГС, позволяет продемонстрировать наличие негативных (репликативных) цепей РНК ВГС, что свидетельствует об активной репликации вируса [33].
В качестве основных вариантов метода можно выделить:
Полимеразная цепная реакция — широко применяемый как в России, так и за рубежом метод детекции РНК ВГС. В его основе лежит многоцикловой процесс, напоминающий естественную репликацию нуклеиновой кислоты, причем каждый цикл состоит из последовательных этапов.
Далее, при помощи фермента ДНК- зависимой ДНК полимеразы происходит синтез новых участков ДНК. В настоящее время в качестве источника этого фермента чаще всего используют бактерии Thermophilus termus (Tth-полимераза) или Thermophilus aquaticus (Taq-полимераза). Обладая термостабильностью в присутствии ионов марганца и магния, этот фермент может быть одновременно использован для синтеза комплементарных одноцепочечных молекул кДНК ВГС и амплификации избранных участков кДНК. На завершающем этапе одного цикла реакции, при помощи ДНК полимеразы происходит синтез новых цепей комплементарных кДНК ВГС. Многократное повторение циклов реакции приводит к накоплению фрагментов кДНК ВГС, которые возможно зарегистрировать при помощи электрофореза в полиакриламидном геле с последующей визуальной детекцией или же с применением гибридизации с олигонуклеотидными зондами, что увеличивает чувствительность и специфичность применяемых диагностических препаратов. Применение праймеров, меченных ферментами, позволяет проводить учет результатов ПЦР при помощи иммуноферментного анализа.
Причины появления ложнонегативных и ложнопозитивных результатов выявления РНК ВГС разнообразны. При ложноотрицательных результатах:
— потеря или разрушение РНК ВГС в ходе подготовки к реакции клинического материала;
— наличие в образце ингибиторов, влияющих на различные компоненты ПЦР. Эти ингибиторы представлены различными химическими или белковыми субстанциями. Например: наличие в спермальной жидкости ингибиторов обратной транскриптазы не позволяло обнаружить РНК ВГС и говорить о возможности реализации полового пути передачи гепатита С [38]; наличие гепаприна [39]; высокий уровень криоглобулинов в сыворотке крови [40];
— несоблюдение теплового режима хранения и транспортировки клинического материала. При ложнопозитивных результатах:
— контаминация между пробами (при обработке образцов и/или работе с реакционной смесью), в том числе и контаминацией позитивным контрольным образцом;
— контаминация продуктами предшествующий амплификации (ампликонами), которые могут загрязнять исследуемые образцы и растворы через аэрозоли или лабораторное оборудование.
Массовое внедрение ПЦР диагностики по определению РНК ВГС поставило перед органами практического здравоохранения задачи перехода на новый уровень проведения лабораторных исследований. Выделение изолированных зон для осуществления основных этапов ПЦР (для подготовки проб; проведения амплификации; для учета полученных результатов); отдельный комплект для каждого этапа реакции лабораторной одежды, автоматических пипеток; существование стандартных диагностических наборов и самое главное — наличие высококвалифицированных лабораторных сотрудников позволяет снизить уровень появления ложных результатов.
Систему выявления РНК ВГС при помощи наборов фирмы «Roche» нельзя рассматривать в отрыве от их приборного обеспечения, определяющего высокое качество тестирования. Разработчики метода стремились к полной автоматизации всех этапов реакции. Воплощением этой идеи стала система «COBASAmpliPrepTM», позволяющая полностью автоматизировать процесс выделения РНК ВГС, амплификации и детекции, тем самым уменьшить риск получения ложнопозитивных и ложнонегативных результатов, сохранив при этом высокую чувствительность и специфичность [41].
Чувствительность этого метода составляет около 200 копий РНК ВГС в мл, что позволяет его использовать для решения различных клинико-диагностических задач [42]. В настоящее время диагностические наборы выявления РНК ВГС, основанные на LCR, изготовлены фирмой «Abbott».
В качестве преимуществ ТМА-метода при выявление РНК ВГС отмечают:
Сравнительные исследования по детекции РНК ВГС при помощи ТМА и другими методами продемонстрировали высокий уровень совпадений результатов [45].
Сочетание принципов гибридизации и амплификации лежит в основе метода выявления РНК ВГС, обозначенного как «Метод гибридизации с использованием разветвленных зондов или Branched DNA assay (bDNA) [46]. В отличие от ПЦР в данном тесте осуществляется амплификация не молекул кДНК ВГС, а сигнала. Реакция проводится в 96 луночных планшетах, на которых адсорбированы фрагменты РНК ВГС из 5′ нетранслируемой зоны и core-гена РНК ВГС. За счет последующего связывания с синтетической молекулой разветвленной ДНК и гибридизацией с пробой, меченной щелочной фосфотазой с усилителем и последующей ферментативной реакцией достигается резкое увеличение полученного сигнала. В настоящее время на диагностическом рынке появились диагностикумы третьего поколения (Вауег 3.0 Hepati-tis С Virus RNA Quantitation by bRNА), обладающие чувствительностью, позволяющей выявлять 520 IU/ml (2500 копий РНК ВГС).
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ РНК ВГС. Для оценки концентрации РНК ВГС применяют количественный вариант ПЦР. Первоначально концентрацию РНК ВГС пытались охарактеризовать порядковыми величинами, например»+»,»++» и т.д., визуально отражающими интенсивность полос, полученных при электрофорезе продуктов амплификации, или же методом конечных разведений, т.е по наличию позитивного результата в конечной точке титрования. Трудности стандартизации всех этапов ПЦР не позволяют объективно оценить концентрацию РНК ВГС, что приводит к существенным ошибкам трактовки полученных результатов.
В настоящее время результаты исследования выражают в количественных единицах: количество копий РНК ВГС, содержащихся в 1 мл., в абсолютном или логарифметическом выражении (log 10). Исходя из того, что концентрация обнаруженной РНК ВГС отражает количество вирусных частиц, данный показатель обозначают как «вирусный эквивалент (eq)», с добавлением приставки k (килограмм, тысяча) или М (миллион). Еще одним способом выражения количества вирусных частиц являются их весовые эквиваленты. Например, в граммах или пикограммах (1 pg соответствует приблизительно 1 миллиону eq). Разнообразие применяемых величин создает трудности трактовки результатов, полученных в различных лабораториях. Поэтому комитет экспертов ВОЗ по биологической стандартизации изготовил «международный стандартный образец», содержащий РНК ВГС (лиофильновысушенная сыворотка крови, содержащая РНК ВГС 1-го генотипа), концентрация которой выражена в международных единицах (IU/mL) [47]. Специальные коэффициенты позволяют пересчитывать полученные показатели концентрации в международные единицы.
Для определения концентрации РНК ВГС применяют практически все варианты ПЦР. При этом к диагностическим препаратам предъявляется ряд специфических требований, важнейшим из которых является строгая линейность результатов, т.е. увеличение сигнала регистрируемой реакции при увеличении концентрации РНК ВГС в исследуемом образце. Применение внутренних стандартов с различным содержанием РНК ВГС позволяет избежать многих методических ошибок, которые могут отразиться на конечном результате реакции [28]. Чувствительность применяемых диагностикумов (Amplicor HCV Monitor v2.0; LCx HCV RNA Quantitative Assay) позволяет выявлять РНК ВГС, начиная с 50 копий в мл [48,49], что особенно важно для прогнозирования эффективности избранной противовирусной терапии.
Отличительной особенностью «ПЦР в реальном времени» считают возможность получать информацию о наличии РНК ВГС непосредственно в процессе реакции, что позволяет уменьшить время анализа в сочетании с высокой чувствительностью и линейностью получаемых результатов [50]. По данным Татьяны Яшиной с соавторами, данный метод позволяет выявлять от 200 копий РНК ВГС в мл. [51].
МЕТОДЫ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ РНК ВГС. Определение принадлежности ВГС к определенному генотипу и субтипу нашло свое применение для решения не только чисто научных, но и практических вопросов. Например: поиск источника инфекции во время вспышек гепатита С или прогнозирование эффективности применяемой терапии.
Методический арсенал определения генотипов ВГС не ограничивается вышеперечисленными способами и включает в себя разнообразные методы:
Серотипирование анти- ВГС по сравнению с генотипированием РНК ВГС обладает такими преимуществами, как простота проведения реакции и более низкая стоимость. Вместе с тем, этот метод ни в коем случае не может заменить генотипирование. Результаты серотипирования анти-ВГС свидетельствуют о типовой принадлежности анти-ВГС при текущей или ранее перенесенной инфекции. В некоторых случаях (наиболее часто у больных гемофилией) регистрируется одновременное выявление анти-ВГС различных подтипов, что может свидетельствовать о множественном инфицировании различными субтипами и генотипами ВГС [63]. Кроме того, у пациентов с гепатитом С на фоне выраженного иммунодефицитного состояния РНК могут быть единственным маркером, что делает невозможным проведение серотипирования.
ВЫЯВЛЕНИЕ и ТРАКТОВКА РЕЗУЛЬТАТОВ ТЕСТИРОВАНИЯ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ВГС-ИНФЕКЦИИ. Наличие широкого спектра серологических маркеров текущей или предшествующей ВГС инфекции, а также современная методологическая база позволяют решить многие задачи лабораторной диагностики и профилактики гепатита С. В таблице № 2 представлены серологические маркеры ВГС инфекции и наиболее важные направления их тестирования.
Таблица 2
Диагностическая значимость маркеров текущей или предшествующей ВГС инфекции
Скрининг
в службе
крови
Подтвер-
ждение
результата
+ анти-ВГС
Одной из главных задач лабораторной диагностики гепатита С является постановка диагноза и разграничение острого от хронического гепатита С при помощи выявления серологических маркеров инфицирования. Так же как и при других острых вирусных гепатитах, серологические маркеры инфицирования ВГС последовательно появляются и исчезают по ходу инфекции и процесса выздоровления (Рисунок 2).
Рис. 2. Острый гепатит С 
Отсутствие маркера, претендующего на роль «золотого» стандарта острого гепатита С, определяет необходимость комплексной оценки полученных результатов, основанных на динамическом наблюдении за пациентом.
Несомненно, перечень вопросов, которые можно решить при тестировании всего спектра маркеров ВГС-инфекции, не исчерпывается этими двумя направлениями. Наличие современных методов тестирования в совокупности со знанием их возможностей открывает широкие перспективы научных и прикладных работ по гепатиту С.