Аликвотировать сыворотку что это
Аликвотировать сыворотку что это
Актуальность. Перипротезная инфекция (ППИ) — одна из сложных проблем здравоохранения. Цель исследования — оценить концентрацию ванкомицина (КВ) на 1, 3, 7-е сутки в сыворотке крови и околосуставной жидкости у больных с ППИ коленного сустава после установки артикулирующего спейсера (СП) с антибиотиком на фоне проведения внутривенной антибактериальной терапии. Материал и методы. Обследованы 17 пациентов с ППИ. В 1-ю группу вошли 9 больных, которым после оперативного вмешательства внутривенно вводили ванкомицин и применяли СП с ванкомицином. Во 2-ю группу включили 8 пациентов, которым был назначены другой антибиотик и СП с ванкомицином. КВ была исследована методом иммунохемилюминесцентного анализа в сыворотке крови и околосуставной жидкости на минимуме концентрации (на 1, 3, 7-е сутки после операции). Результаты. У пациентов 1-й группы средняя КВ в сыворотке крови на 1-е сутки после операции приближалась к терапевтической — 16,8 [9,8; 16,9] мкг/мл, на 3-и и 7-е сутки она составила соответственно 20,18 [16,6; 22,69] и 16,43 [13,2; 27,3] мкг/мл. В околосуставной жидкости на 1-е и 3-и сутки обнаружены высокие КВ — 59,84 [57,3; 74,0] и 43,0 [36,53; 31,2] мкг/мл соответственно, снижающиеся к 7-м суткам до 29,94 [21,44; 36,5] мкг/мл, однако значительно превышающие минимальную ингибирующую концентрацию выделенных возбудителей. Во 2-й группе в сыворотке пациентов на 1, 3-и и 7-е сутки определялись низкие КВ — 2,86 [1,23; 3,9], 3,05 [1,25; 4,25]; 3,14 [2,16; 3,47] мкг/мл соответственно. В околосуставной жидкости на 1-е и 3-и сутки КВ были высокими — 52,95 [20,4; 60,4], 31,36 (22,6; 36,5] мкг/мл соответственно, однако с постепенным снижением к 7-м суткам до 11,09 [8,69; 17,15] мкг/мл. Достоверная разница КВ в околосуставной жидкости у больных 1-й и 2-й групп была получена только на 7-е сутки после операции (U=7; р
Инфекционные осложнения при эндопротезировании крупных суставов — одна из значимых медицинских и социально-экономических проблем. Частота проявлений инфекционных осложнений при тотальном эндопротезировании коленного сустава (ТЭКС) — 0,4—4%, при тотальном эндопротезировании тазобедренного сустава (ТЭТБС) — 0,3—2,2% [1]. По прогнозам к 2030 г. ожидается увеличение инфекционных осложнений до 6,8 и 6,5% соответственно. Лечение перипротезной инфекции (ППИ) ложится серьезным экономическим бременем на здравоохранение [2]. Ежегодные расходы на ревизионное эндопротезирование по поводу инфекционных осложнений в США возросли за 2001—2009 гг. с 320 до 566 млн долларов США. Ожидается, что к 2020 г. эти расходы превысят 1,62 млрд долларов США [3, 4].
Причиной развития поздней хронической ППИ, как правило, является перенос возбудителей из очагов острой и хронической инфекции (целлюлит, диабетическая стопа, инфекции кожи, периодонта, дыхательных и мочевыводящих путей) [2, 5]. В основе патогенеза ППИ лежит способность микроорганизмов формировать биопленки на поверхности имплантатов. Возбудители ППИ в форме биопленки становятся устойчивыми к факторам иммунной защиты, включая фагоцитоз, и действию антимикробных препаратов [6—9].
Современная классификация ППИ опирается на процесс развития микробной биопленки. В зависимости от стадии ее развития выделяют раннюю ППИ с незрелой биопленкой, которая возникает в течение первых 4 нед после имплантации эндопротеза, и хроническую — со зрелой биопленкой, которая проявляется в сроки более 4 нед после имплантации [2]. Таким образом, в случае хронической ППИ эффективное лечение возможно только при условии удаления инфицированного имплантата.
Препаратом выбора для лечения ППИ, вызванной метициллинрезистентной (MR) бактерией Staphy-lococcus aureus (золотистый стафилококк) и коагулазонегативными стафилококками, является ванкомицин [10—13]. От 20 до 90% интраоперационно создаваемых плазменных концентраций ванкомицина (КВ) могут проникать в структуру кости в зависимости от ее васкуляризации и плотности [14]. При локальном применении препарата в составе цементного спейсера 1 (СП) максимальное количество антибиотика высвобождается в течение первых нескольких суток после имплантации, затем элюция замедляется, продолжаясь в течение нескольких недель и месяцев [6, 14]. По данным литературы, локальное использование ванкомицина позволяет поддерживать его концентрацию в области имплантата на высоком уровне в течение нескольких суток после операции [5, 6, 19].
В качестве эффективной терапевтической КВ в сыворотке крови для лечения инфекций, вызванных MR золотистым стафилококком, принимается остаточная концентрация 15—20 мкг/мл [15]. В отношении других возбудителей уровень сывороточной концентрации должен быть в несколько раз выше минимальных ингибирующих концентраций (МИК) для выделенных микробиологических культур пациентов [6, 15]. В настоящее время нет единого мнения по поводу клинически эффективной КВ в околосуставной жидкости. Согласно клиническим рекомендациям, в зависимости от вида стафилококка МИК ванкомицина должна быть до 4 мкг/мл [16].
Существуют сообщения об исследованиях КВ в биологических жидкостях (сыворотка крови, дренажная и синовиальная жидкость, костная ткань) при ППИ. При использовании костных трансплантатов, импрегнированных ванкомицином, обнаружены высокие уровни экскретированного антибиотика, которые подавляли ванкомицин-чувствительные стафилококки в течение всего 16-суточного периода наблюдения [17].
Группой авторов [18] было проведено исследование концентраций ванкомицина и азтреонама в сыворотке крови и синовиальной жидкости методом высокоэффективной жидкостной хроматографии у 46 пациентов с ППИ после первого этапа ревизионного эндопротезирования с установкой СП на цемент, а также взятых интраоперационно во время второго этапа. В 1-е сутки после установки СП в околосуставной жидкости наблюдались высокие уровни антибиотиков (ванкомицин 1538,0±243,6 мкг/мл; азтреонам 1003,5±323,5 мкг/мл). Концентрация антибиотиков в сыворотке крови через 1 сут после операции была низкой (ванкомицин 0,58±0,2 мкг/мл, азтреонам 0,46±0,3 мкг/мл). Через 107 сут после первого этапа реэндопротезирования концентрации антибиотиков в синовиальной жидкости (второй этап) были значительно выше МИК для наиболее распространенных микроорганизмов.
Оптимальный уровень локальной концентрации антибиотика и необходимая длительность его поддержания при лечении ППИ на настоящее время остаются предметом дискуссии.
Цель исследования — оценить КВ на 1, 3, 7-е сутки в сыворотке крови и околосуставной жидкости у больных с ППИ коленного сустава после установки артикулирующего СП с антибиотиком на фоне проведения внутривенной антибактериальной терапии.
Материал и методы
Обследовали пациентов с ППИ, находящихся на лечении в ФГБУ ФЦТОЭ МЗ Р.Ф. Барнаула. У большинства больных (76,4%) преобладали стафилококки: в 38% случаев S. aureus, в 62% — коагулазонегативные стафилококки. MR штаммы стафилококков составляли 40,5% [10].
В исследование включили 17 пациентов (14 женщин, 3 мужчины) с диагнозом хронической ППИ коленного сустава. Диагноз был установлен согласно принятым критериям ППИ [13, 20], выделенный возбудитель был чувствителен к ванкомицину. Критериями исключения являлись почечная недостаточность, индивидуальная непереносимость ванкомицина, поверхностная инфекция.
Всем пациентам было проведено двухэтапное реэндопротезирование с применением на первом этапе временного артикулирующего СП, импрегнированного ванкомицином. Все исследования и манипуляции, в том числе пункции сустава, осуществлялись по показаниям в рамках лечебного процесса.
Пациенты были разделены на две группы. В 1-ю группу вошли 9 больных, получавших ванкомицин внутривенно и локально в составе СП. У пациентов этой группы были выделены в 3 случаях MR S. epidermidis (MRSE), по одному случаю P. magnus и MR S. aureus (MSSA), еще в 4 случаях при наличии клинических проявлений инфекции роста микробиологической культуры не было получено.
Во 2-ю группу включили 8 пациентов, которым были назначены 2 разных антибиотика: внутривенно амоксициллин/клавуланат, линезолид или цефоперазон/сульбактам, и локально в составе СП ванкомицин. У пациентов этой группы были определены в 4 случаях MSSA, по одному случаю стрептококк, стрептококк и кишечная палочка, MRSE, еще в одном случае при наличии клинических проявлений инфекции роста микробиологической культуры не было выявлено. После получения окончательных результатов микробиологических исследований у части пациентов терапия была изменена.
Изготовление СП производилось интраоперационно на основе компонентов эндопротеза коленного сустава с использованием полиэтиленового вкладыша и бедренного компонента эндопротеза с сохранением задней крестообразной связки. Взятие материала (кровь и околосуставная жидкость) проводилось на 1, 3-и и 7-е сутки после операции. Околосуставную жидкость брали на 1-е и 3-и сутки с помощью дренажной трубки, подведенной в рану, на 7-е сутки путем пункции сустава. Материал набирался в шприц в объеме 3—5 мл. Кровь для исследования забирали из периферической вены предплечья через установленный венозный катетер в вакуумные пробирки VACUETTE, для сыворотки — PREMIUM («Greiner Bio-One», Австрия) в объеме 5 мл перед очередным внутривенным введением антибактериального препарата.
Таким образом, определение КВ выполнялось параллельно в сыворотке крови и околосуставной жидкости на минимуме концентрации (до введения препарата). Кровь центрифугировали 15 мин при g=1500. Сыворотку аликвотировали и замораживали при –20 °С. Собранную околосуставную жидкость из шприца помещали в аналогичную вакуумную пробирку. После доставки в лабораторию околосуставную жидкость также центрифугировали, при наличии в надосадочной жидкости фибриновых сгустков супернатант подвергали повторному центрифугированию. Полученный материал аликвотировали и замораживали при –20 °С. Непосредственно перед исследованием пробы биологических жидкостей были разморожены и исследованы в одной аналитической серии на иммунохимической системе ADVIA CENTAUR CP («Siemens Healthcare GmbH», Германия) с реагентами ADVIA Centaur VANC MCM («Siemens Healthcare GmbH», Германия) методом прямого иммунохемилюминесцентного анализа.
Статистическая обработка проводилась с помощью программы Microsoft Excel. С учетом того, что были использованы непараметрические методы статистического анализа, результаты представлены в виде медианы и интерквартильного диапазона. Для всех статистических критериев был принят критический уровень значимости р 
Рис. 1. Распределение К.В. в сыворотке крови в обеих группах на 1, 3, 7-е сутки. 2). Достоверная разница КВ в околосуставной жидкости у больных 1-й и 2-й групп была получена только на 7-е сутки после операции (Uэмп=7; р 
Рис. 2. Распределение К.В. в околосуставной жидкости в обеих группах на 1, 3, 7-е сутки.
Патологических отклонений креатинина в сыворотке крови и скорости клубочковой фильтрации в обеих группах пациентов выявлено не было. У всех больных после проведения первого этапа отсутствовали клинические признаки воспаления. Уровень С-реактивного белка в 1-е сутки составлял 118,6 [97,8; 123,4] мг/л и постепенно снижался к 7-м суткам до 58,3 [41,7; 67,5] мг/л, что соответствовало обычному течению послеоперационного периода. Уровень СОЭ значимо не изменялся на всех контрольных точках.
Второй этап эндопротезирования у всех пациентов был проведен в среднем через 11 [7; 12] нед. У больных обеих групп после двухэтапного реэндопротезирования признаков рецидива инфекции не отмечались (средний период наблюдения 26,1 [17,2; 27,3] мес).
Заключение
1. КВ в околосуставной жидкости после установки СП с антибиотиком с 1-х по 7-е сутки наблюдения значительно превышали МИК для наиболее распространенных грамположительных возбудителей ППИ в обеих группах пациентов.
2. Отмечалось снижение КВ в околосуставной жидкости в обеих группах к 7-м суткам, однако его концентрация оставалась выше МИК.
3. При сочетании системного и локального применения ванкомицина на 7-е сутки у пациентов достигались достоверно более высокие локальные концентрации антибиотика в полости коленного сустава по сравнению с группой, использовавшей СП с ванкомицином и системным введением другого антибиотика.
4. В отдаленном периоде (средний период наблюдения 26,1 [17,2; 27,3] мес) рецидивов ППИ у пациентов обеих групп не было зафиксировано.
5. Мониторинг К.В. в сыворотке крови у больных с ППИ позволяет использовать более высокие дозы препарата и достигать значительных концентраций в области инфекции, не увеличивая при этом риск повреждения почек.
6. Необходимы дополнительные клинические исследования для уточнения связи уровней сывороточной и околосуставной КВ и других антибиотиков с исходом лечения инфекционного процесса.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.
Роль биобанкирования в организации крупномасштабных эпидемиологических исследований
Полный текст:
Аннотация
Успех и качество проведения крупномасштабных эпидемиологических исследований полностью зависят от качества используемого биоматериала. Поэтому повышенное внимание при организации исследования ЭССЕ-РФ-3 (Эпидемиология сердечно-сосудистых заболеваний и их факторов риска в регионах Российской Федерации. Третье исследование) было уделено разработке методологии сбора, обработки и дальнейшей транспортировки биологических образцов и ассоциированных с ними клинических и антропометрических данных участников из региональных пунктов сбора в Биобанк.
Цель. Разработка методологии сбора биоматериала высокого качества в рамках проведения беспрецедентного крупномасштабного эпидемиологического исследования, предполагающего взятие, обработку, замораживание образцов крови и ее производных (сыворотка, плазма) в регионах, транспортировку полученных биообразцов и их размещение на ответственное хранение в Биобанк ФГБУ “НМИЦ ТПМ” Минздрава России.
Материал и методы. Для проведения исследования ЭССЕ-РФ-3 разработан дизайн исследования, согласно которому во всех участвующих регионах запланирован сбор образцов венозной крови в суммарном объеме 29,5 мл от каждого участника с целью получения и хранения образцов цельной крови, сыворотки и двух видов плазмы крови.
Результаты. На основе международных стандартов биобанкирования, этических норм, опыта проведения проектов ЭССЕ-РФ, ЭССЕ-РФ-2 и анализа данных литературы разработан протокол биобанкирования образцов крови и ее производных. Определены тип и количество получаемых в результате обработки крови аликвот сыворотки и плазмы, необходимый стандартный набор технических средств и расходных материалов, требования к логистике биоматериала; разработаны обучающие материалы для исполнителей в регионах и необходимое программное обеспечение. К началу августа 2021г по проекту ЭССЕ-РФ-3 в соответствии с разработанной методологией (регламентом) собрано, обработано и помещено на хранение 180 тыс. образцов цельной крови, сыворотки и плазмы крови от более чем 23 тыс. участников из 28 регионов РФ.
Заключение. Проведенная работа позволила оценить и подтвердить соответствие разработанного протокола биобанкирования требованиям в отношении качества получаемых биообразцов и ассоциированных с ними данных, однако в связи с пандемией новой коронавирусной инфекции к августу 2021г работа Биобанка не достигла максимальной производительности, прогнозируемой для проекта ЭССЕ-РФ-3.
Ключевые слова
Для цитирования:
Покровская М.С., Борисова А.Л., Метельская В.А., Ефимова И.A., Долудин Ю.В., Козлова В.А., Серебрянская З.З., Баланова Ю.А., Мешков А.Н., Пустеленин А.В., Имаева А.Э., Шальнова С.А., Концевая А.В., Драпкина О.М. Роль биобанкирования в организации крупномасштабных эпидемиологических исследований. Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2021;20(5):2958. https://doi.org/10.15829/1728-8800-2021-2958
For citation:
Pokrovskaya M.S., Borisova A.L., Metelskaya V.A., Efimova I.A., Doludin Yu.V., Kozlova V.A., Serebryanskaya Z.Z., Balanova Yu.A., Meshkov A.N., Pustelenin A.V., Imaeva A.E., Shalnova S.A., Kontsevaya A.V., Drapkina O.M. Role of biobanking in managing large-scale epidemiological studies. Cardiovascular Therapy and Prevention. 2021;20(5):2958. https://doi.org/10.15829/1728-8800-2021-2958
Введение
Исследование ЭССЕ-РФ-3 (Эпидемиология сердечно-сосудистых заболеваний и их факторов риска в регионах Российской Федерации. Третье исследование) — третий этап уникального крупномасштабного исследовательского проекта, посвященного изучению распространенности сердечно-сосудистых заболеваний и их факторов риска в различных регионах РФ [1]. В рамках этого этапа проекта запланировано и выполняется обследование представительных выборок мужчин и женщин 25-64 лет (n=60 тыс.), проживающих в 30 регионах РФ с различными климатогеографическими характеристиками. Формирование выборок осуществлялось по территориальному принципу на базе региональных лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ) по методу Киша [2].
ЭССЕ-РФ-3 — эпидемиологическое исследование, изучающее распространенность факторов риска хронических неинфекционных заболеваний в масштабе страны. Такие исследования, выполняемые на регулярной основе, позволяют создать систему мониторинга состояния здоровья населения РФ.
Исследование ЭССЕ-РФ-3 состоит из 3 этапов: 1) заполнение вопросника, 2) проведение инструментальных исследований и 3) выполнение лабораторных измерений. Включение в исследование ряда биохимических показателей позволяет проанализировать их ассоциации с социально-демографическими и клиническими характеристиками обследованных лиц. Лабораторные исследования запланировано выполнять централизованно в клинико-диагностической лаборатории ФГБУ “НМИЦ терапии и профилактической медицины” Минздрава России (НМИЦ ТПМ). Для этого было необходимо провести взятие крови и пробоподготовку в регионах, а затем транспортировать биообразцы в Биобанк НМИЦ ТПМ. Очевидно, что успех подобного масштабного научного исследования полностью зависит от качества используемого биоматериала. Поэтому повышенное внимание при организации третьего этапа исследования было уделено разработке методологии проведения сбора, обработки и дальнейшей транспортировки биологических образцов и ассоциированных с ними клинических и антропометрических данных участников из региональных пунктов сбора в Биобанк НМИЦ ТПМ.
Биобанком называется коллекция биологического материала и сопутствующей информации, хранящаяся в организованной системе, которая может быть использована в популяционных и клинических исследованиях в настоящий момент или в будущем [3][4]. Ключевым отличием биобанка от исследовательских коллекций является обеспечение ответственного безопасного хранения биоматериала, строгое соблюдение этических требований и стандартов проведения процедур сбора, обработки, транспортировки и хранения биологических образцов, а также наличие ассоциированных с ними данных пациентов/доноров.
Роль биобанка в организации эпидемиологических исследований трудно переоценить. Использование в научно-исследовательской деятельности биоматериала, собранного, обработанного и хранимого по единым правилам и стандартам, является гарантией достоверности, воспроизводимости и высокого качества получаемых результатов в текущих и будущих научно-медицинских исследованиях [5][6].
Наиболее известным и ярким примером организации и проведения крупномасштабного сбора и долгосрочного хранения биообразцов и ассоциированных с ними данных является биобанк Великобритании (UK Biobank) [7][8], собравший в течение 4-х лет образцы крови, мочи и слюны от 500 тыс. британцев в возрасте 40-69 лет. Уникальность проекта заключается в максимальной полноте и доступности данных, ассоциированных с биообразцами, для ученых по всему миру.
Биобанк НМИЦ ТПМ. Для проведения запланированных лабораторных исследований в рамках проекта ЭССЕ-РФ-3, а также для долгосрочного ответственного хранения и обеспечения высокого качества биообразцов и ассоциированных с ними данных, собранных в региональных пунктах, биоматериал транспортируют в Биобанк НМИЦ ТПМ, организованный и функционирующий согласно требованиям международных стандартов.
Образованный в 2014г Биобанк НМИЦ ТПМ является центром систематического сбора и ответственного хранения коллекций биологических образцов высокого качества и ассоциированной с ними клинической и лабораторной информации для обеспечения ведения научной работы в рамках крупномасштабных эпидемиологических проектов, а также других исследовательских проектов, проводимых научными подразделениями НМИЦ ТПМ. Качество получаемых и хранимых биообразцов и ассоциированных с ними данных подтверждается международным сертификатом качества по стандарту ISO 9001:2015, полученным нашим Биобанком. К началу проведения ЭССЕ-РФ-3 в Биобанке уже хранился собранный в ходе первого и второго этапов эпидемиологического исследования ЭССЕРФ биоматериал (>20 тыс. чел.) из 12 регионов РФ, а также образцы цельной крови, сыворотки и плазмы крови из 33 исследовательских проектов научных подразделений НМИЦ ТПМ. На август 2021г общее количество биообразцов составляет >459 тыс.
Сотрудниками Биобанка накоплен большой опыт организации биобанкирования образцов крови и ее производных в рамках проведения масштабных эпидемиологических исследований (ЭССЕРФ, ЭССЕ-РФ-2), что позволило в кратчайшие сроки разработать усовершенствованную методологию сбора и транспортировки биоматериала для гораздо более крупномасштабного этапа проекта.
Безопасное хранение полученных биообразцов в Биобанке обеспечивается современным оборудованием, включающим низкотемпературные морозильные камеры, автоматизированную систему непрерывного мониторинга параметров среды, бесперебойное электроснабжение, программное обеспечение, позволяющее систематизировано и безопасно хранить большой объем данных, ассоциированных с биообразцами. Качество получаемых и хранимых биообразцов и ассоциированных с ними данных подтверждается международным сертификатом качества по стандарту ISO 9001:2015 “Quality management systems — Requirements”.
В рамках подготовки к исследованию ЭССЕРФ-3 проведено проектирование и ввод в эксплуатацию новых помещений Биобанка, предназначенных для хранения биоматериала и организованных в соответствии с передовым мировым опытом в этой области.
Соблюдение этических требований достигается путем подписания участником исследования добровольного информированного согласия, утвержденного Этическим комитетом НМИЦ ТПМ, и деперсонализации личных данных.
Цель исследования — разработка методологии сбора биоматериала высокого качества в рамках проведения беспрецедентного крупномасштабного эпидемиологического исследования, предполагающего взятие, обработку, замораживание образцов крови и ее производных (сыворотка, плазма) в регионах, транспортировку полученных биообразцов и их размещение на ответственное хранение в Биобанк НМИЦ ТПМ.
Материал и методы
Для проведения сбора биоматериала согласно протоколу исследования ЭССЕ-РФ-3 на основе международных стандартов биобанкирования, этических норм, опыта проведения проектов ЭССЕ-РФ, ЭССЕ-РФ-2 и анализа литературных данных 9 сотрудниками Биобанка НМИЦ ТПМ разработан дизайн сбора образцов венозной крови в суммарном объеме 29,5 мл от каждого участника с целью получения и хранения образцов цельной крови, сыворотки и двух видов плазмы крови во всех участвующих в исследовании регионах по единому регламенту.
В дизайне определены тип и количество получаемых в результате обработки крови аликвот сыворотки и плазмы (таблица 1); расчет был проведен таким образом, чтобы охватить как можно более широкий спектр потенциальных исследований на этом биоматериале в настоящих и будущих проектах. Количество аликвот от каждого участника исследования определяли, исходя из вида и количества запланированных анализов, а также из необходимости соблюдения условия однократного использования биообразца без повторения циклов замораживания/оттаивания. Дополнительно в двенадцати из тридцати регионов ЭССЕ-РФ-3 в дизайн исследования было включено проведение в регионах анализа уровня гликированного гемоглобина (HbA1c).
Таблица 1
Тип и количество аликвот, получаемых в ЭССЕ-РФ-3
Примечание: ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота, ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота, HbА1c — гликированный гемоглобин.
Для безопасного ответственного хранения биоматериала и информационного сопровождения используются морозильные камеры Биобанка и программа FreezerPRO.
Информированные согласия с идентификационным номером участника вместо персональных данных, подписанные всеми участниками ЭССЕ-РФ-3 в двух экземплярах, хранятся в специальном хранилище Биобанка.
Результаты и обсуждение
Согласно дизайну исследования, разработана методология (пакет протоколов) проведения сбора, обработки, транспортировки и хранения биологических образцов. Стандартные операционные процедуры (СОП), подробно описывают процессы сбора, обработки биоматериала, регистрацию в программе ввода данных, температурные режимы и сроки выдержки биообразцов до обработки и во время хранения, подготовки биоматериала к транспортировке в Биобанк, а также процессы экспорта данных из программы и формы, которые необходимо заполнять с целью формирования базы данных. Созданы платформа и программа для регистрации биообразцов и формирования базы данных. Строгое соблюдение данного регламента и использование разработанного программного обеспечения соответствует стандартам биобанкирования и обеспечивает высокое качество получаемого биоматериала и информационного сопровождения.
Для всех регионов, принимающих участие в исследовании, был определен стандартный набор оборудования и расходных материалов, необходимых для получения биообразцов. Применение такого подхода снижает риски влияния технических характеристик и настроек различного оборудования на качество биообразцов. Например, при использовании морозильных камер разного температурного режима может различаться время замораживания образца, тогда как использование единого набора оборудования и расходных материалов позволяет организовать работу по единому стандарту, включающему СОП по каждому из этапов и видеоинструкции.
Ключевым фактором, влияющим на качество биообразцов, наличие, полноту и достоверность сопровождающих его данных, является точность выполнения инструкций. Сотрудниками Биобанка был разработан пакет демонстрационных материалов, включающий инструкцию, презентацию и видеофильм, подробно описывающие все действия сотрудников региональных ЛПУ, начиная с процедуры получения образцов крови от участников исследования и заканчивая подготовкой биоматериала и сопровождающей документации к транспортировке. В каждом регионе проведено обучение исполнителей проекта с использованием этих материалов. Кроме того, продолжается оперативное регулярное в режиме онлайн консультирование региональных исполнителей по всем возникающим вопросам сбора, пробоподготовки и транспортировки биоматериала по стандартам биобанкирования.
Основные этапы биобанкирования
Процедура сбора биоматериала. К работе с вакуумными системами забора крови допускается только сертифицированный медицинский персонал. Образцы периферической (венозной) крови должны собираться в асептических условиях, с использованием стерильных игл и переходников, в маркированные уникальными индексами образцов пробирки типа “BD Vacutainer”.
Участникам исследования необходимо соблюдать ряд общих рекомендаций: накануне взятия крови исключить физические нагрузки, стрессовые ситуации, физиотерапевтические процедуры; прием лекарственных средств (решение об отмене медикаментозного лечения принимает лечащий врач), оральных контрацептивов; употребление спиртных напитков и жирной пищи. Не курить непосредственно перед исследованием в течение 1 ч. В процедурном кабинете ЛПУ осуществляют стандартное взятие крови утром натощак (не менее чем через 12 ч после последнего приема пищи) в условиях физиологического покоя, из локтевой вены.
Перед процедурой забора крови медицинская сестра подготавливает все необходимое:
1. Отделяет от рулона этикеток этикетки с 6-значным порядковым номером очередного участника (рисунок 1), на которых содержится следующая информация: верхняя строка — название региона, нижняя строка — 6 значный номер участника XXNNNN (ХХ — номер региона согласно общероссийскому классификатору объектов административно-территориального деления, NNNN — порядковый номер участника) и тип биологического образца, который должен быть получен из данной пробирки (S, PK, K) (таблица 1, рисунок 1).
В набор этикеток для одного участника также входит этикетка для маркировки направления с обозначением BEG.
2. Заполняет направление (рисунок 2): ФИО участника и присвоенный ему уникальный 8-значный идентификационный номер, наклеивает этикетку с 6-значным порядковым номером, записывает время взятия крови.
Уникальный 8-значный идентификационный номер присваивается каждому участнику на начальной стадии исследования при формировании выборки с использованием метода Киша. Однако использование в работе только этого кода создает ряд трудностей в работе медицинских работников ЛПУ, поскольку часть респондентов, попавших в выборку, может отказаться от участия в исследовании, кроме того, участники приходят на сдачу крови непоследовательно по присвоенным идентификационным номерам, что приводит к затруднениям в поиске необходимых этикеток для маркировки пробирок. Чтобы упростить работу медицинских работников дополнительно была введена система 6-значных последовательных номеров, присваиваемых каждому участнику, пришедшему в ЛПУ.
3. Наклеивает этикетки на пробирки для взятия крови: одна пробирка с желтой крышкой на 8,0 мл для получения сыворотки крови (маркировка S), одна — с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) с фиолетовой крышкой на 9,0 мл для получения цельной крови (маркировка K), две — с ЭДТА с фиолетовой крышкой на 4,0 мл для получения цельной крови и плазмы с ЭДТА (маркировка K), одна — с цитратом натрия с голубой крышкой на 4,5 мл для получения плазмы с цитратом натрия (маркировка PK) (рисунок 3).
Рис. 1 Набор этикеток для первичных пробирок и направления для одного участника.
Рис. 2 Форма направления.
Рис. 3 Набор первичных пробирок для взятия крови от одного участника исследования.
Этические требования, регламентирующие процесс биобанкирования, не допускают нанесения на пробирки персональных данных участников (ФИО). 8-значный идентификационный номер участника с информационно-регистрационной карты вносится в направление, а на пробирки наклеивают этикетки с 6-значным номером, соответствующим порядковому номеру очередного участника. Порядковый 6-значный номер участника связывается с идентификационным 8-значным в компьютерной программе, используемой для регистрации биообразцов. Таким образом осуществляется деперсонализация данных. Врачами, ведущими прием участников исследования, заполняются так называемые “переводные таблицы”, в которых содержатся персональные данные участников и соответствующие им идентификационные номера. Ни сотрудники, осуществляющие пробоподготовку биоматериала, ни сотрудники НМИЦ ТПМ, доступа к персональным данным участников не имеют.
Большое значение имеет последовательность забора биоматериала: первыми наполняют пробирки с желтой крышкой, затем — с голубой, и в конце — с фиолетовой. Сразу после взятия крови содержимое пробирок с фиолетовой и голубой крышками осторожно перемешивают, плавно переворачивая пять раз, и ставят в штатив в вертикальном положении. Встряхивание пробирок недопустимо, поскольку может привести к гемолизу образца. Содержимое пробирок с жёлтыми крышками (не содержащими антикоагулянта) не перемешивают.
По окончании процедуры медсестра проверяет заполненное направление и передает пробирки и направление лаборанту для проведения пробоподготовки.
Пробоподготовка — обработка биологического материала после взятия крови. Процедура пробоподготовки состоит из этапов центрифугирования крови и аликвотирования образцов. Все пробирки центрифугируют через 30 мин после взятия крови. Важно не увеличивать время перед центрифугированием для пробирок с цитратом натрия (с голубыми крышками) для получения плазмы крови для коагулогических исследований. Время до центрифугирования пробирок с желтыми и фиолетовыми крышками может составлять до 1 ч. Пробирки с фиолетовой крышкой объемом 9,0 мл и 4,0 мл, предназначенные для замораживания цельной крови, не центрифугируют.
Пробирки центрифугируют при температуре +4 0 С со скоростью 1900 g (3260 (об./мин) в течение 15 мин. По окончании процедуры необходимо убедиться, что сыворотка/плазма четко отделена от клеточных компонентов, нет клеточных компонентов над осадком, нет гемолиза или хилеза. При возникновении проблем с отделением сыворотки/ плазмы или образованием сгустка проводят повторное центрифугирование. В случае гемолизированной или хилезной сыворотки/плазмы процедуру взятия крови необходимо провести повторно.
Полученные образцы сыворотки и плазмы крови аликвотируют в криопробирки, содержащие заводские уникальные линейные штрих-коды на боковой части и 2D-штрих-коды на дне (рисунок 4). Этот штрих-код криопробирки соединяется с уже введенным в базу данных 8-значным идентификационным номером соответствующего участника при сканировании в программу ввода данных по биообразцам “ЭССЕ-РФ-3”. В этих пробирках сыворотка и плазма крови транспортируется и хранится.
Аликвотирование биообразцов из пробирок с желтой, голубой и фиолетовой крышками производится автоматическим дозатором с использованием одноразовых наконечников объемом 100-1000 мкл. При отборе сыворотки и плазмы важно забирать только чистую сыворотку и плазму, не смешивая её с кровяным сгустком и не дотрагиваясь кончиком наконечника до слоя осадка. После аликвотирования каждого типа биообразца наконечник необходимо менять.
При аликвотировании плазмы с ЭДТА из пробирок с фиолетовой крышкой, объемом 4,0 мл, следует оставить над осадком в пробирке слой плазмы в 1 мм. Эту пробирку с клеточным осадком следует заморозить наряду с двумя другими пробирками с фиолетовой крышкой, содержащими цельную кровь с ЭДТА. Эти биообразцы будут использованы для проведения генетических исследований.
В процессе пробоподготовки важно фиксировать время начала центрифугирования и аликвотирования, а также количество и объем полученных аликвот в листе “Информация о биообразцах” (форма информационного листа представлена на рисунке 5). Благодаря заполнению этой табличной формы повышается точность дальнейшей работы с программой, а необходимая информация дублируется на бумажном носителе.
Рис. 4 Криопробирки с уникальным 2D-штрихкодом для длительного хранения образцов сыворотки и плазмы крови.
Рис. 5 Форма информационного листа “Информация о биообразцах”.
Примечание: S — сыворотка крови, PE — плазма крови с ЭДТА, PK — плазма крови цитратная.
Программа ввода данных. Информация о собранном биоматериале вводится и хранится в базе данных проекта ЭССЕ-РФ-3. Ввод информации о биообразцах осуществляется с помощью специальной программы “ЭССЕ-РФ-3”. Разработанная IT-платформа еще при выполнении проекта ЭССЕРФ-2 была существенно усовершенствована для проведения ЭССЕ-РФ-3. Она позволяет регистрировать и отслеживать информацию по процессингу биообразцов и ассоциированных с ними данных в режиме онлайн. Это явилось важным этапом подготовки к проведению исследования. Программа предусматривает использование так называемой маски ввода (рисунок 6). В программу вводится информация: 8-значный идентификационный номер участника при первичной его регистрации, затем отсканированные штрих-коды всех полученных типов образцов, название и номер региона, ФИО сотрудника, осуществляющего пробоподготовку, дата и время взятия крови, время начала центрифугирования, время заморозки и статус отправки из региона в Биобанк. Данные хранятся в деперсонализированном виде, что отвечает всем этическим требованиям к проведению подобных исследований и регламенту биобанкирования.
Рис. 6 Интерфейс программы ввода и хранения данных, ассоциированных с биообразцами.
Информация о виде биообразца вводится путем сканирования штрих-кодов, расположенных на криопробирках и на этикетках вакутейнеров с цельной кровью и клеточным осадком, в соответствующую ячейку программы ввода данных — К для образцов цельной крови, S — для сыворотки, РК — для цитратной плазмы, РЕ — для плазмы с ЭДТА (рисунок 7).
Рис. 7 Окно для ввода информации, закодированной в штрих-кодах криопробирок.
Дополнительно программа позволяет генерировать списки биообразцов в виде таблиц в формате Excel.
В конце каждого рабочего дня замороженные пробирки с фиолетовыми крышками собирают в зип-пакет, маркированный текущей датой. В этот же зип-пакет закладывают “Информационный лист” текущего дня.
Биообразцы при транспортировке сопровождаются пакетом документов:
Порядок действий при подготовке к отправке биоматериала из регионального пункта сбора в Биобанк. Организацией транспортировки биоматериала из региональных центров сбора в Биобанк занимается специалист-менеджер Биобанка, в обязанности которого входит: отслеживание сроков хранения биообразцов в ЛПУ, соблюдение временных интервалов отгрузок партий биоматериала с момента начала сбора образцов и далее каждые 3 нед., связь с региональным исполнителем, получение информации о количестве готового к отправке биоматериала, согласование с транспортной компанией объема поставки, времени отправки из пункта сбора биоматериала, а также времени прибытия в Биобанк. Параллельно региональный исполнитель проекта готовит файл со списком номеров готовых к отправке биообразцов из программы ввода данных и пересылает его по электронной почте в Биобанк.
В согласованные день и время исполнители проекта в регионе вместе с курьером транспортной компании перемещают биообразцы, находящиеся в штативах, из морозильной камеры в транспортировочный пакет и в транспортный контейнер в толщу сухого льда, там же размещают температурный логгер и зип-пакеты с пробирками, содержащими цельную кровь и клеточный осадок.
Листы “Информация о биообразцах”, информированные согласия и акты приема-передачи упаковывают в отдельный пакет.
Прием биоматериала, поступающего из регионов, в Биобанк. В Биобанке регистрация биоматериала, транспортируемого из регионов, осуществляется следующим образом:
1) сканирование штативов с образцами сыворотки и плазмы, а также пробирок с цельной кровью и клеточным осадком;
2) экспорт файлов в CSV-формате (табличный файл), содержащих информацию о биообразцах;
4) внесение отредактированных файлов в программу FreezerPRO.
Для проведения запланированных по проекту лабораторных исследований с определенной согласованной периодичностью Биобанк передает образцы сыворотки в клинико-диагностическую лабораторию НМИЦ ТПМ. Результаты исследований автоматически попадают в базу данных ЭССЕРФ-3 и становятся доступными в регионах для выдачи участникам. При необходимости проведения дополнительных исследований с использованием сохраняемых биообразцов Биобанк осуществляет выдачу аликвот биоматериала по определенному регламенту, включающему согласование с руководителями исследования ЭССЕ-РФ-3.
К началу августа 2021г по проекту ЭССЕРФ-3 в соответствии с разработанной методологией было собрано, обработано и помещено на ответственное хранение 180 тыс. образцов цельной крови, сыворотки и плазмы крови от более чем 23 тыс. участников из 28 регионов РФ. Значительное негативное влияние на скорость реализации проекта оказала пандемия новой коронавирусной инфекции COVID-19, повлекшая замедление темпа сбора биоматериала в регионах. В связи с этим в настоящее время работа Биобанка НМИЦ ТПМ не достигла максимальной производительности, прогнозируемой для проекта ЭССЕ-РФ-3, однако проведенная работа уже позволила оценить и подтвердить соответствие разработанного протокола биобанкирования требованиям в отношении качества получаемых биообразцов и ассоциированных с ними данных.
Стоит отметить и важность влияния человеческого фактора на проведение исследования. В рамках действующей в Биобанке НМИЦ ТПМ системы менеджмента качества по стандарту ISO 9001:2015 “Quality management systems — Requirements” пристальное внимание уделяется процессу управления несоответствиями. Их своевременное выявление и информирование сотрудников региональных ЛПУ позволяют оперативно разрабатывать корректирующие мероприятия, контролировать выполнение каждого их этапов процесса биобанкирования, снизить вероятность повторного возникновения ошибок и, как следствие, значительно повышать качество получаемых биообразцов и ассоциированных с ними данных [3][16].
Таким образом, разработанную и реализованную методологию сбора, пробоподготовки, транспортировки и хранения биообразцов в рамках проведения ЭССЕ-РФ-3 по своему масштабу, превышающему все предыдущие эпидемиологические исследования в России, можно рассматривать в качестве универсального инструмента для получения и хранения высококачественного биологического материала человека.
Заключение
В заключение следует отметить, что успешное проведение крупномасштабных эпидемиологических проектов, предполагающих сбор, обработку, транспортировку и долгосрочное ответственное хранение большого количества биоматериала и данных из многочисленных регионов России, требует тщательного планирования и комплексного подхода к организации, включая создание пакета протоколов проведения всех этапов работы по единому стандарту:
Очевидно, что при организации крупномасштабных эпидемиологических исследований на современном этапе Биобанк является необходимым центральным звеном. Именно регламент биобанкирования и централизованное управление процессом сбора биоматериала обеспечивает высокое качество собранного биоматериала, необходимое для получения достоверных и воспроизводимых результатов исследований. Благодаря единому регламенту в Биобанке собирается уникальная структурированная коллекция биоматериала от представительной выборки населения из 30 регионов РФ для исследований в рамках ЭССЕ-РФ-3 и для будущих научных проектов.
На основе международных стандартов биобанкирования, этических норм, опыта проведения проектов ЭССЕ-РФ, ЭССЕ-РФ-2 и анализа литературных данных разработан протокол биобанкирования образцов крови и ее производных, который может использоваться при организации и выполнении крупномасштабных исследовательских проектов.
Несмотря на то, что в настоящее время работа Биобанка НМИЦ ТПМ не достигла пиковой производительности, прогнозируемой для проекта ЭССЕ-РФ-3, что связано с пандемией новой коронавирусной инфекции, проведенная работа позволила оценить и подтвердить соответствие разработанного протокола биобанкирования требованиям в отношении качества получаемых биообразцов и ассоциированных с ними данных.
Собираемый в рамках исследования биоматериал потенциально дает возможность проводить в будущем широкий круг метаболомных, протеомных и геномных исследований.
Список литературы
1. Научно-организационный комитет проекта ЭССЕ-РФ. Эпидемиология сердечно-сосудистых заболеваний в различных регионах России (ЭССЕ-РФ). Обоснование и дизайн исследования. Профилактическая медицина. 2013;16(6):25-34.
2. Kish L. Survey Sampling. New York: John Wiley and Sons, 1965. 643 p. ISBN: 047148900X (ISBN13: 9780471489009).
3. Покровская М.С., Борисова А.Л., Сивакова О.В. и др. Управление качеством в биобанке. Мировые тенденции и опыт биобанка ФГБУ “НМИЦ профилактической медицины” Минздрава России. Клиническая лабораторная диагностика. 2019;64(6):380-4. doi:10.18821/0869-2084-2019-64-6-380-384
4. Резник О. Н., Кузьмин Д. О., Скворцов А.Е. и др. Биобанки — неоценимый ресурс трансплантации. История, современное состояние, перспективы. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2016;18(4):123-32. doi:10.15825/1995-1191-2016-4-123-132.
5. Prinz F, Schlange T, Asadullah K. Believe it or not: how much can we rely on published data on potential drug targets? Nature Reviews Drug Discovery. 2011;10(9):712. doi:10.1038/nrd3439-c1.
6. Problems with scientific research: How science goes wrong. The Economist. 2013;Oct, 19th. https://www.economist.com/leaders/2013/10/21/how-science-goes-wrong.
7. Elliott P, Peakman TC. The UK Biobank sample handling and storage protocol for the collection, processing and archiving of human blood and urine. International J Epidemiol. 2008;37(2):234-44. doi:10.1093/ije/dym276.
8. Sudlow C, Gallacher J, Allen N, et al. UK biobank: an open access resource for identifying the causes of a wide range of complex diseases of middle and old age. PloS Med. 2015;12(3):e1001779. doi:10.1371/journal.pmed.1001779.
9. Анисимов С. В., Глотов А. С., Гранстрем О. К. и др. Биобанки и прогресс биомедицины: сб. научн. тр. п/ред. С. В. Анисимова. Санкт-Петербург: Свое издательство, 2018, 86 c. ISBN: 978-5-4386-1648-1.
10. Долудин Ю.В., Борисова А.Л., Покровская М. С. и др. Современные передовые практики и рекомендации по биобанкированию. Клиническая лабораторная диагностика. 2019; 64(12):769-76. doi:10.18821/0869-2084-2019-64-12-769-776.
11. Покровская М.С., Сивакова О.В., Мешков А. Н. и др. Организация биобанкирования биообразцов в рамках второго этапа эпидемиологического исследования сердечно-сосудистых факторов риска и заболеваний в регионах Российской Федерации (ЭССЕ-РФ2). Профилактическая медицина. 2018;21(2-2):44-5.
12. Iacoviello L, Curtis AD, Donati MB, et al. Biobanks for cardiovascular epidemiology and prevention. Future Cardiol. 2014;10(2):243-54. doi:10.2217/fca.13.110.
13. ISO 20387:2018 Biotechnology — Biobanking — General requirements for biobanking. https://www.iso.org/standard/67888.html.
14. Козлова В. А., Метельская В. А., Покровская М. С. и др. Изучение стабильности биохимических маркеров при непрерывном длительном хранении сыворотки крови и при однократном размораживании. Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2020;19(6):2736. doi:10.15829/1728-8800-2020-2736.
15. Сивакова О. В., Покровская М. С., Ефимова И. А. и др. Контроль качества образцов сыворотки и плазмы крови для научных исследований. Профилактическая медицина. 2019;22(5):91-7. doi:10.17116/profmed20192205191.
16. ISO 9001:2015 Quality management systems — Requirements. https://www.iso.org/standard/62085.html.
Об авторах
Покровская Мария Сергеевна — ведущий научный сотрудник, руководитель лаборатории “Банк биологического материала”.
Борисова Анна Львовна — ведущий инженер лаборатории “Банк биологического материала”.
Метельская Виктория Алексеевна — доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник, руководитель отдела изучения биохимических маркеров риска хронических неинфекционных заболеваний.
Ефимова Ирина Александровна — ведущий эксперт лаборатории “Банк биологического материала”.
Долудин Юрий Валерьевич — научный сотрудник лаборатории “Банк биологического материала”.
Козлова Виктория Александровна — младший научный сотрудник “Банк биологического материала”.
Серебрянская Зарина Зитоселовна — лаборант лаборатории “Банк биологического материала”.
Баланова Юлия Андреевна — ведущий научный сотрудник отдела эпидемиологии хронических неинфекционных заболеваний, кандидат медицинских наук.
Мешков Алексей Николаевич — кандидат медицинских наук, руководитель лаборатории молекулярной генетики.
Пустеленин Антон Владимирович — начальник отдела информационных технологий и связи.
Имаева Асия Эмверовна — кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник отдела эпидемиологии хронических неинфекционных заболеваний.
Шальнова Светлана Анатольевна — доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник, руководитель отдела эпидемиологии хронических неинфекционных заболеваний.
Концевая Анна Васильевна — доктор медицинских наук, доцент, заместитель директора по научной и аналитической работе.
Драпкина Оксана Михайловна — доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАН, директор.
Для цитирования:
Покровская М.С., Борисова А.Л., Метельская В.А., Ефимова И.A., Долудин Ю.В., Козлова В.А., Серебрянская З.З., Баланова Ю.А., Мешков А.Н., Пустеленин А.В., Имаева А.Э., Шальнова С.А., Концевая А.В., Драпкина О.М. Роль биобанкирования в организации крупномасштабных эпидемиологических исследований. Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2021;20(5):2958. https://doi.org/10.15829/1728-8800-2021-2958
For citation:
Pokrovskaya M.S., Borisova A.L., Metelskaya V.A., Efimova I.A., Doludin Yu.V., Kozlova V.A., Serebryanskaya Z.Z., Balanova Yu.A., Meshkov A.N., Pustelenin A.V., Imaeva A.E., Shalnova S.A., Kontsevaya A.V., Drapkina O.M. Role of biobanking in managing large-scale epidemiological studies. Cardiovascular Therapy and Prevention. 2021;20(5):2958. https://doi.org/10.15829/1728-8800-2021-2958