Антагонистическая активность что это
Антагонистическая активность что это
Одной из важнейших проблем современного здравоохранения является нарушение микробиоценоза желудочно-кишечного тракта (дисбактериоз), которое встречается у 70-90% населения большинства стран мира, в том числе и в России. Поэтому для профилактики и коррекции дисбактериозов крайне перспективным и экономически выгодным является создание доступных пробиотических препаратов.
Цель: оценить антагонистическую активность и биосовместимость перспективных для селекции потенциальных в качестве пробиотиков штаммов бифидобактерий и лактобактерий.
Материалы и методы
Исследовали антагонистическую активность пробиотических штаммов бифидобактерий (Bifidobacterium bifidum 791, B.bifidum 1, B.longum B379M, B.longum 2C) и лактобацилл (Lactobacillus acidophilus (helveticus ТШ) NK1) методом отсроченного антагонизма (Баженов Л.Г., 1997) по отношению к тест-культурам микроорганизмов: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus subtilis 534, E.coli ATCC 25922, Shigella sonnei I фазы 941, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Klebsiella pneumoniae K1 5054, Candida albicans ATCC 885-653. Биосовместимость бифидобактерий и лактобацилл между собой, представителями нормофлоры человека (14 музейных штаммов лактобацилл и энтерококков, выделенных из полости рта и фекалий здоровых людей) и другими пробиотическими штаммами (Lactobacillus acidophilus, выделенный из препарата «Линекс» (Словения), производственный штамм L.plantarum 8RA-3) изучали методами перпендикулярных штрихов и совместного культивирования на поверхности твердой питательной среды (по Н.А.Глушановой, 1999).
Результаты исследования
При определении антагонистической активности бифидобактерий и лактобацилл, была выявлена их высокая активность как по отношению грампозитивных, так и грамнегативных микроорганизмов, особенно B.subtilis, Shigella sonnei и Pseudomonas aeruginosa. Однако в отношении дрожжеподобных грибов рода Candida испытуемые штаммы были не активны. Установлено, что исследуемые бифидобактерии и лактобациллы не оказывают антагонистического воздействия между собой. В результате определения антагонистической активности исследуемых бифидобактерий и лактобацилл по отношению к представителям нормофлоры человека и другим пробиотическим штаммам установлено отсутствие их взаимного антагонизма.
Выводы
Таким образом, изученные штаммы лактобацилл и бифидобактерий могут быть использованы в качестве пробиотических штаммов при создании безопасного и эффективного пробиотика.
Дисбактериоз кишечника с определением антагонистической активности пробиотиков
Микробиологическое исследование, позволяющее оценить качественный и количественный состав облигатных, условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов в кале, а также определить наличие антагонистической активности основных пробиотиков в отношении выявленных микроорганизмов.
Для чего используется этот анализ?
Когда назначается анализ?
Дисбиоз кишечника, определение пробиотиков-антагонистов.
Синонимы английские
Intestinal dysbiosis, antagonistic activity of probiotics, Intestinal dysbacteriosis.
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Как правильно подготовиться к исследованию?
Общая информация об исследовании
Основной способ диагностики дисбактериоза – это микробиологический метод, при котором производят качественную и количественную оценку облигатных, условно-патогенных и патогенных микроорганизмов в кале. На основании результатов исследования делают вывод о дефиците облигатных микроорганизмов или об избыточном росте условно-патогенных или патогенных бактерий. Детальный лабораторный анализ – основа для эффективного лечения дисбактериоза.
Микробиологическое исследование – это один из наиболее специфических и чувствительных методов исследования, применяемых при диагностике дисбактериоза. Следует, однако, помнить, что бактериологический состав кала (он используется в качестве биоматериала) несколько отличается от бактериологического состава слизистой оболочки кишки. Кроме того, результат теста может зависеть от многих других факторов, таких как недавнее употребление антибактериальных препаратов, продуктов, богатых пробиотиками, или слабительных средств.
Результат анализа оценивают с учетом дополнительным лабораторных и инструментальных данных.
Для чего используется исследование?
Когда назначается исследование?
Антагонистическая активность что это
Популяции микроорганизмов, вступая в сложные взаимоотношения – конкурентные или кооперативные, при заселении различных частей органов, тканей микроорганизма формируют его специфический «микросимбиоценоз» [7]. При описании форм природных и искусственных сообществ микроорганизмов в литературе используется термин «ассоциации». В работах последнего десятилетия прошлого века для описания ассоциативных отношений или эктосимбиозов стали использовать термин «ассоциативный симбиоз» [8]. По мнению О.В. Бухарина, ассоциативный симбиоз – это многокомпонентная интегральная система, включающая хозяина в качестве макропартнера, стабильный доминантный микросимбионт и ассоциированные микросимбионты с разнонаправленными воздействиями, определяющими формирование, стабильность существования и продуктивность симбиоза в целом [2].
Большой интерес для исследований ассоциативных эктосимбиозов с микроорганизмами представляет ризосфера (узкая область почвы вдоль поверхности корней), так как она богато заселена микроорганизмами, оказывающими полифункциональное положительное влияние на растения [4]. Для обозначения таких бактерий используют термин plant growth promoting rhizobacteria (PGPR). Стимулирующие рост растений ассоциативные ризобактерии оказывают влияние на физиологические процессы растений, урожайность и качество растительной продукции [5], поэтому они все шире применяются в отечественном и мировом земледелии. Ризосфера служит их основной экологической нишей с наиболее благоприятными условиями [9]. В ризосферу из корней активно поступают сложные смеси легкодоступных органических источников энергии и углерода, что обусловливает ее высокую микробиологическую активность и образование отличающихся от почвенного микробоценоза специфических ризосферных микробных сообществ [7, 10].
На поверхности вегетативных подземных органов растений в основном доминируют грамотрицательные бактерии родов Pseudomonas, Erwinia, Xanthomonas, Flavobacterium, а в ризосфере и ризоплане растений – Pseudomonas, Flavobacterium, Agrobacterium, Azospirillum [2, 4]. Механизм действия этих микроорганизмов на фитопатогены включает конкуренцию за источник питания, эффективную колонизацию ризосферы, синтез антибиотических и рострегулирующих веществ [1]. Ассоциативные микроорганизмы, выделяющие в процессе роста антибиотические гетерогенные низкомолекулярные вещества, способны при низких концентрациях подавлять активность других микроорганизмов и тем самым влиять на жизнедеятельность растений [5].
Для изучения взаимодействий с полезными формами бактерий в ризосфере продуктивна концепция, согласно которой ассоциативные ризобактерии образуют с растением единую растительно-микробную систему с новыми свойствами, детерминированными положительным взаимодействием партнёров [2]. К ассоциативным предложено относить виды микроорганизмов, оказывающие положительное влияние на растения, но колонизирующие только поверхности органов и/или свободные пространства тканей. Ассоциативные микроорганизмы обитают в зоне прямого влияния растений, прилегающей к корням в почве или заселяют поверхность корней. Ризосферные микроорганизмы формируют на корнях растений сложные по таксономическому составу и структурно-функциональной организации сообщества, которые оказывают на растения полифункциональное воздействие [4].
Механизмы положительного влияния ризобактерий на жизнедеятельность растений делят на прямые и опосредованные. К прямым способам воздействия на растения предлагают относить: ассоциативную азотфиксацию, образование ростстимулирующих веществ, обеспечение легкоусвояемыми формами железа, фосфора и/или поглощение их из почвы и доставку в растения, формирование специфических трофических связей, уменьшение уровня этилена. Непрямые способы – предотвращение или уменьшение роста фитопатогенных почвенных микроорганизмов за счет выделения бактерицидных и антифунгальных метаболитов [2, 9].
Одной из важнейших проблем современного растениеводства являются фитопатогены, не только «традиционные» (облигатные), но и так называемые полиморфные группы грибов, включающие как сапротрофные, так и паразитические формы, многие из которых известны как биоразрушители, патогены культурных и дикорастущих растений [10]. Большинство сортов сельскохозяйственных культур в среднем реализуют только 20–25 % генетического потенциала продуктивности. При обеспечении защиты от возбудителей болезней, вредителей и сорняков они способны формировать значительно больший урожай. Среднемировой уровень потерь вследствие поражения сельскохозяйственных растений фитопатогенными микроорганизмами оценивается в 12 %. Это определяет важность защиты растений как одного из факторов интенсивного растениеводства. Установлено, что в борьбе с возбудителями болезней растений возможно использовать бактерии, обладающие антагонистическим действием по отношению к фитопатогенам [9]. Имеются сведения о том, что формирование эффективной растительно-бактериальной ассоциации определяется не только количеством выделяемых растением в ризосферное пространство растворимых органических соединений (экссудатов), но и их качественным составом, влияющим на приживаемость и размножение штамма в ризосфере. По этой причине можно говорить об относительной приуроченности штаммов PGPR к определенным видам и даже сортам растений, имеющим специфические характеристики химических корневых выделений [10]. Однако до сих пор антагонистическая активность ризосферных бактерий по отношению к фитопатогенам остается малоизученной.
Целью исследования явилось изучение антагонистической активности растительно-бактериальных ассоциантов по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре.
Материалы и методы исследования
Для выделения и идентификации используемых культур использовали такие питательные среды, как ЖСА, Эндо и МПА (Оболенск). Видовую идентификацию выделенных микробных ассоциантов проводили на основе изучения их морфологических, тинкториальных и биохимических свойств [6]. Для выявления Pseudomonas fluorescens использовали люминесцентную микроскопию (микроскоп – МИКМЕД-6 ЛЮМLed).
Антагонистический эффект выявляли у бактерий Pseudomonas fluorescens и Bacillus subtilis. В качестве тест-объекта использовали Staphylococcus aureus и Escherichia coli, обладающие типичными свойствами. Staphylococcus aureus – грамположительные кокки, диаметром 0,5–1,5 мкм, расположенные в мазке в виде небольших групп или виноградных гроздей, неподвижные (не имеют жгутиков), не образующие спор. Биохимически очень активны: продуцировали каталазу, восстанавливали нитриты из азота, обладали способностью гидролизовать белки, расщеплять многие углеводы в аэробных условиях. S. aureus расщепляли маннит и глюкозу не только в аэробных условиях, но и в анаэробных. Escherichia coli – короткие подвижные грамотрицательные палочки с закругленными концами, ферментировали лактозу с образование кислоты и газа (или лактозонегативны), на голодной среде c цитратом не расли, реакция Фогеса‒Проскауэра отрицательна, проба с MR положительна, не имели фенилаланиндезаминазы, не давали рост на среде с KCN [6]. Определение антимикробной активности проводили методом перпендикулярных штрихов [3]. Испытуемые штаммы наносили в виде штриха по диаметру, после инкубации 2–3 суток при температуре 37 °С к штаммам перпендикулярно подсевали тест-объекты (S.aureus и E.coli.). Антимикробные вещества, диффундирующие в толщу агара, задерживали рост чувствительных к ним микроорганизмов, что проявлялось в образовании зон отсутствия роста микробов (мм). О наличии и степени антагонистической активности у испытуемой бактерии судили по величине зоны ингибирования тест-штамма на границе со штрихом роста бактерии.
Результаты исследования и их обсуждение
Проведенные исследования показали, что в микробоценозе ризосферы и ризопланы изученных семейств растений преобладали Pseudomonas fluorescens и Bacillus subtilis, характерной особенностью P. fluorescens являлись флюоресценция в ультрафиолетовом цвете, расщепление оксидазы и окисление глюкозы OF. P. fluorescens, в отличие от B.subtilis обладали подвижностью. B.subtilis проявляли маннит- и каталазаположительную активность, не расщепляли мочевину, обладали способностью к спорообразованию и давали положительную реакцию Фогеса‒Проскауэра (табл. 1).
Биохимическая активность ризосферных бактерий
Дисбактериоз кишечника с определением антагонистической активности пробиотиков и определением чувствительности к бактериофагам
Микробиологическое исследование, позволяющее оценить качественный и количественный состав облигатных, условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов в кале, определить антагонистическую активность основных пробиотиков в отношении выявленных микроорганизмов и их чувствительность к бактериофагам.
Для чего используется этот анализ?
Когда назначается анализ?
Дисбиоз кишечника, определение пробиотиков-антагонистов и чувствительности к фагам.
Синонимы английские
Intestinal dysbiosis, antagonistic activity of probiotics and bacteriophage sensitivity test, Intestinal dysbacteriosis.
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Как правильно подготовиться к исследованию?
Общая информация об исследовании
Основным способом диагностики дисбактериоза является микробиологический метод, при котором производят качественную и количественную оценку облигатных, условно-патогенных и патогенных микроорганизмов в кале. На основании результатов исследования делают вывод о дефиците облигатных микроорганизмов или об избыточном росте условно-патогенных или патогенных бактерий. Микробиологическое исследование – это один из наиболее специфических и чувствительных методов исследования, применяемых при диагностике дисбактериоза. Следует, однако, помнить, что бактериологический состав кала (он используется в качестве биоматериала) несколько отличается от бактериологического состава слизистой оболочки кишки. Кроме того, результат теста может зависеть от многих других факторов, таких как недавнее употребление антибактериальных препаратов, продуктов, богатых пробиотиками, или слабительных средств.
Результат анализа оценивают с учетом дополнительным лабораторных и инструментальных данных.
Для чего используется исследование?
Когда назначается исследование?
Антагонистическая активность что это
Поэтому целью данного исследования явилось определение антагонистической активности пробиотических штаммов лактобактерий в отношении клинических штаммов кандид с использованием разных методов, для осуществления которой предстояло решить следующие задачи – выделить чистые культуры штаммов грибов, пробиотических штаммов лактобацилл и реализовать выбранные методы: 1) совместное культивирование на твердой питательной среде; 2) совместное инкубирование в стерильном физиологическом растворе и, для сравнения, в жидкой питательной среде.
Совместное культивирование опытных штаммов на твердой питательной среде осуществляли по собственной опытным путем подобранной методике, создающей условия как из метода двухслойного агара благодаря возможности растущим культурам контактировать с метаболитами друг друга, так и метода посева штрихами, при котором культуры находятся на достаточно близком друг от друга расстоянии. На основе препарата «Максилак бэби» готовили суспензию в стерильном физиологическом растворе хлорида натрия. С той целью к 0,1г взвешенного в стерильной посуде лиофилизата добавляли 9,9мл стерильного физиологического раствора, через 15 минут тщательно перемешивали стерильной палочкой и раскапывали по 0,5мл в стерильные чашки Петри диаметром 95мм. Затем в каждую чашку добавляли по 20 мл расплавленного теплого стерильного лактоагара и перемешивали с суспензией вращательными движениями на плоскости.
После застывания агара на его поверхность мерной петлей (10мкл) наносили приготовленную на стерильном физиологическом растворе суспензию 48-часовой культуру кандид (10 5 КОЕ/мл), предварительно субкультивированных на лактоагаре, и распределяли прокаленным и остуженным шпателем. В качестве контроля использовали посевы кандид на лактоагаре при отсутствии пробиотических штаммов, а также посев синбиотического препарата в лактоагар без кандид.
Посевы инкубировали в аэробной атмосфере при температуре 37°C в течение 48 часов, затем подсчитывали количество выросших на поверхности агара колоний дрожжеподобных грибов при наличии роста пробиотических штаммов в толще питательной среды.
Антагонистическая активность оценивалась как слабая в случае уменьшения количества колоний грибов по сравнению с контролем на 0,6-3,2 lg, как умеренная – на 3,4-5,8 lg и высокая – на 5,9-6,5 lg [9].
При совместном культивировании штаммов на твердой питательной среде на всех чашках с лактоагаром отмечался видимый рост пробиотических штаммов в виде газона внутри пласта среды без выхода на поверхность. Количество колоний грибов в контрольных посевах соответствовало 10 3 КОЕ. В условиях совместного культивирования только у одного штамма кандид количество выросших колоний не отличалось от контроля, у остальных штаммов оно оказалось ниже: на один порядок у одного и на 2 порядка у четырех, что соответствует слабой антагонистической активности.
При совместном инкубировании в физиологическом растворе антагонистическая активность лактобактерий проявилась только в отношении 1 штамма гриба (количество клеток было снижено по сравнению с контролем на 0,6 lg), аналогичные данные были получены при совместном культивировании в сахарном бульоне. Также отмечено преобладание количества колоний остальных штаммов грибов над количеством лактобактерий в обоих условиях культивирования на 2 – 3 lg.
Таким образом, синбиотические штаммы лактобацилл по результатам используемого нами метода совместного культивирования на твердой питательной среде обладают слабой антагонистической активностью в отношении опытных штаммов кандид. Это может быть обусловлено и комплексным посевом синбиотика без выделения чистых культур его лактобацилл. Следует отметить, что данный подход уже осуществлялся нами путем посева десятикратных разведений синбиотического препарата в слой лактоагара с последующей инкубацией в аэробных условиях и пересевом отдельных выросших колоний в МРС-бульон в стерильные центрифужные пробирки с завинчивающимися крышками и столбики лактоагара для получения биомассы для приготовления суспензии инокулюма чистой культуры. Но, в отличие от лиофилизата, она не дает газонного роста культуры и, поэтому, заметной антагонистической активности.
Отсутствие антагонистической активности чистой культуры лактобактерий в отношении 3х штаммов грибов при совместном инкубировании как физиологическом растворе, так и в сахарном бульоне может быть обусловлена их устойчивостью к метаболитам лактобацилл, которые могут синтезироваться в питательной среде размножающейся популяцией или вовсе отсутствовать при данных условиях инкубирования. Следует отметить, что у беременных при нормоценозе и кандидозном поражении влагалища, согласно данным литературы, L.fermentum выделяется, но не относится к доминирующим видам данного биотопа (Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus gasseri), в случае кандидозного вагинита, однако L.fermentum занимает 4 место по частоте выделяемости [5]. Поэтому для них может быть не характерна активная выработка фунгицидных метаболитов.
Главным же представляется тот факт, что в литературе имеются сведения о различных типах взаимодействия в смешанных бульонных культурах между представителями рода Lactobacillus и грибами рода Candida, изучаемых в настоящее время и не обязательно носящих антагонистический характер [3,4]. Наличие антагонистической активности лактобацилл при инкубировании в жидкой среде только в отношении одного штамма кандид обусловлено, очевидно механизмами кворум-сенсинга, которые функционируют у сочетаний одних и тех же таксономических групп по-разному и, зависят, от конкретного штамма [3,4].
Отсутствие антагонистической активности лактобактерий в отношении трех штаммов грибов при использовании второго метода – совместного инкубирования в жидкой фазе еще и с количественным преобладанием кандид может быть обусловлено накапливаемыми в настоящее время данными о необходимости пересмотра концепции однонаправленного влияния штаммов одного вида микроорганизмов на другой вид (например, антагонизм лактобацилл – потенциальных «штаммов-ингибиторов» в отношении кандид – ожидаемых штаммов-мишеней) в концепцию взаимовлияния разных видов друг на друга.