Weissella confusa что это

Микрофлора молочнокислых бактерии и дрожжей в 19-ти итальянских заквасок

Микрофлора молочнокислых бактерии и дрожжей 19 заквасок, используемых для традиционных/стандартных видов итальянского хлеба: взаимодействие между ингредиентами и разнообразие видов микробов

Фабио Минервини, Раффаэлла ДиКагно, Анна Латтанци, Мария Де Ангелис, Ливио Антониэлли, Джанлуиджи Кардинали, Стефан Каппелле и Марко Гоббетти

Исследование микрофлоры 19 итальянских заквасок, используемых для изготовления традиционного хлеба, позволило идентифицировать при помощи культурально-зависимого подхода 20 видов молочнокислых бактерий (LAB) и 4 вида дрожжей. Численно, наиболее частыми изолятами молочнокислых бактерий были Lactobacillus sanfranciscensis (примерно 28% от общего количества изолятов LAB), Lactobacillus plantarum (приблизительно 16%), и Lactobacillus paralimentarius (около 14%). Saccharomyces cerevisiae были обнаружены в 16 заквасках. Также были обнаружены Candida humilis, Kazachstania barnettii, и Kazachstania exigua. Как показывает анализ основных компонентов (PCA), была обнаружена корреляция между ингредиентами, особенно типом муки, микробным сообществом и биохимическими особенностями закваски. Мука из твердых сортов пшеницы характеризовалась высоким уровнем мальтозы, глюкозы, фруктозы, и свободных аминокислот (FAA), коррелирующих с единственным или доминирующим наличием облигатно гетероферментативных молочнокислых бактерий, наименьшим количеством факультативно гетероферментативных штаммов и низкой плотностью клеток дрожжей в зрелых заквасках. Это исследование при помощи системного и сравнительного подхода выделило доминирующие микрофлоры 19 итальянских заквасок, которые определили некоторые особенности традиционных видов итальянского хлеба.

Данное исследование было направлено на определение микрофлоры молочнокислых бактерий и дрожжей 19 итальянских заквасок, используемых для изготовления традиционных/стандартных видов итальянского хлеба. Доминирующие молочнокислые бактерии и дрожжи были изучены при помощи культурально-зависимых методов. Были проведены многопараметрические статистические исследования для того, чтобы найти корреляцию между ингредиентами и составом микрофлоры закваски, а также воздействием последних на биохимические характеристики закваски.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Было изучено 19 заквасок, используемых для изготовления традиционных/стандартных типов итальянского хлеба (таблица 1). Хлеб на закваске представлял несколько итальянских регионов (см. рис.S1 в дополнительных материалах). Таблица 1 обобщает ингредиенты и технологические параметры исследованных заквасок. Три партии каждой закваски брали три дня подряд из местных пекарен. Все образцы были взяты сразу в конце использования и хранились при температуре 4 °C в течение нескольких часов перед анализом. Все анализы проводились по крайней мере дважды для каждой партии закваски (всего шесть анализов для каждого типа закваски).

Определение рН, углеводов, органических кислот, этанола и свободных аминокислот.

Значения рН определялись с помощью рН-метра. Десять граммов неферментированного теста (мука и вода, выход теста [DY; (вес теста/вес муки) × 100] из 160) или зрелой закваски были гомогенизированы 90 мл буферного раствора Трис- HCl, 50 мМ (pH 8,8) и в течение 3 мин обрабатывались в гомогенизаторе BagMixer 400P (Interscience, Сен Ном, Франция). После инкубации (при температуре 25°C в течение 30 мин с помешиванием) суспензию центрифугировали (12 857 × г, 10 мин, 4 °C). Надосадочная жидкость (водорастворимый экстракт) была проанализирована на концентрацию углеводов (неферментированное тесто) и органических кислот (зрелая закваска). Они были определены жидкостной экспресс-хроматографией белков (FPLC) с использованием системы очистки ÄKTA (GE Healthcare Bio-Sciences, Уппсала, Швеция), оснащенной детектором коэффициента преломления (Perkin Elmer Corp., Уолтем, Массачусетс, США). Коэффициент ферментации (QF) был определен как молярное соотношение между D, L-молочной и уксусной кислотами. Концентрация этанола определялась ферментационным методом (EnzyPlus; BioControl Systems, Inc., США). Концентрация свободных аминокислот в водорастворимых экстрактах неферментированного теста и зрелой закваски определялись с использованием аминокислотного анализатора Biochrom 30 (Biochrom LTD, Кембриджский научный парк, Англия) (11). Смесь аминокислот с известной концентрацией (Sigma Chemical Co., Милан, Италия) была добавлена вместе с цистеиновой кислотой, метионинсульфоксидом, метионином сульфона, триптофаном и орнитином и была использована в качестве внешнего стандарта (11).

Перечисление и изоляция молочнокислых бактерий и дрожжей.

Характеристика генотипа при помощи анализа RAPD-PCR (ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК).

Геномная ДНК молочнокислых бактерий была извлечена по методу де Лос-Рейес-Гавилан и др. (14). Три олигонуклеотида: P1 (5′-GCGGCGTCGCTAATACATGC-3′), P4 (5′-CCGCAGCGTT-3′), и M13 (5′-GAGGGTGGCGGTTCT-3′), с произвольно выбранными последовательностями были использованы для биотипирования изолятов молочнокислых бактерий. Реакционная смесь и условия PCR анализа для праймеров P1 и P4 были описаны Де Ангелисом и др. (10). Условия PCR для праймера M13 соответствовали данным Сирагуза и др. (38). Произвольно амплифицированные полиморфные профили ДНК (RAPD)-PCR были получены с помощью системы документации Gel Doc 2000 и были сравнены при помощи оборудования снятия отпечатков II Informatix Software (Bio-Rad Laboratories). Сходство электрофоретических профилей оценивалось путем определения коэффициентов сходства Дайса и использованием невзвешенного попарно-группового метода с применением алгоритма средних связей (UPGMA). Поскольку профили RAPD изолятов из одной партии каждого типа закваски были подтверждены путем анализа изолятов из двух других партий, штаммы, изолированные из одной партии, были дополнительно проанализированы.

Геномная ДНК была извлечена из дрожжевых изолятов, как описано Кардинали и др. (5). Анализ RAPD-PCR с праймером (GACA)4 с рассеянными повторяющимися последовательностями (iSSR) был использован для определения дрожжей на уровне штаммов. Протокол PCR был ранее описан Андраде и др. (2), PCR был выполнен с ферментом EuroTaq (EuroClone, Милан, Италия) в одноградиентном термоциклическом аппарате (EuroClone). Сходство электрофоретических профилей оценивалось путем определения коэффициентов сходства Дайса и использования алгоритма UPGMA. Так как профили RAPD изолятов из одной партии каждого типа закваски были подтверждены путем анализа изолятов из двух других партий, штаммы, полученные из одной партии, были дополнительно проанализированы.

Генотипическая идентификация молочнокислых бактерий и дрожжей.

Идентификация штаммов проводилась с использованием двух пар праймеров (Invitrogen Life Technologies, Милан, Италия), LacbF/LacbR и LpCoF/LpCoR, для амплификации гена 16S рРНК молочнокислых бактерий (13). Праймеры, предназначенные для гена recA, также использовались для выявления видов L. plantarum, Lactobacillus pentosus и Lactobacillus paraplantarum с использованием многолокусного PCR (40). Праймеры PheS были использованы для идентификации на уровне видов в пределах родов Enterococcus, Weissella, и Leuconostoc (30). Праймеры casei/para использовались для определения видов Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei и Lactobacillus rhamnosus (48).

Геномная ДНК была извлечена из дрожжей методами, описанными выше. Домен D1/D2 гена 26S рРНК был амплифицирован и секвенирован в соответствии с процедурой, описанной Курцманом и Робнеттом (26). Электрофорез проводился на агарозном геле при 1,5% (вес/объем) (Gellyphor; EuroClone), ампликоны были очищены с помощью PCR ДНК с глюкозой, фруктозой и ксилитом, гелевым набором для очистки (GE Healthcare). Данные секвенирования электроферограммы были обработаны с помощью Geneious. Выравнивание последовательностей генов rRNA было выполнено с использованием метода множественного выравнивания последовательностей (17), а запросы идентификации были выполнены с помощью поисковой системы BLAST (1) в базе генетических данных (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/).

Статистический анализ.

Данные (по крайней мере три биологические репликации) для мальтозы, глюкозы, фруктозы, свободных аминокислот, рН, органических кислот, этанола и плотности клеток были подвергнуты одностороннему дисперсионному анализу (ANOVA), а парное сравнение методов обработки было достигнуто при помощи метода Туки при P Перечисление молочнокислых бактерий и дрожжей.

Определение количества микроорганизмов посевом на чашках Петри с использованием среды с четырьмя культурами показало различные значения предполагаемых молочнокислых бактерий (рис. 1). Помимо среды культивирования и с учетом наивысшего значения для каждой закваски среднее количество микроорганизмов посевом на чашках Петри составило 9,01 log КОЕ г-1. 25-й и 75-й процентили собранных данных составили 8,75 и 9,13 log КОЕ г-1, соответственно. Это различие можно объяснить качественными и количественными различиями между средами с точки зрения питательных веществ и различных метаболических возможностей штаммов, содержащихся в каждой закваске. Почти аналогичные различия значений плотности дрожжевых клеток были обнаружены между средой агара с солодовым экстрактом и средой декстрозного агара Сабуро (рис. 2). Независимо от среды культивирования и с учетом наивысшего значения для каждой закваски, среднее значение составило 7,30 log КОЕ г-1. Соотношение между молочнокислыми бактериями и дрожжами 19 итальянских заквасок варьировалось от 100:1 до 10:1, единственными исключениями являются закваски Pane di Matera PGI (приблизительно 1000:1) и Pane Casareccio di Genzano PGI (приблизительно 1:1).

Типирование и идентификация молочнокислых бактерий.

Грамположительные, каталаза-отрицательные, неподвижные кокки и палочки, способные окислить питательную среду Мозера-Рогоза-Шарпа, бульонную питательную среду Сабуро с глюкозой, питательную среду MRS5, или бульон глюкозы-М17 (411 изолятов) были подвергнуты анализу RAPD-PCR (таблица 3). Воспроизводимость отпечатков RAPD была оценена путем сравнения продуктов PCR, полученных праймерами P1, P4, и M13 и ДНК, извлеченными из трех отдельных культур одного и того же штамма. Для этого было изучено 10 штаммов, и модели для одного и того же штамма были схожи приблизительно на 90% (данные не предоставлены) согласно анализу UPGMA. Комбинированные профили RAPD были подвергнуты кластерному анализу UPGMA (данные не предоставлены). На основе воспроизводимости анализа RAPD-PCR изоляты, показывающие значительно (P

Типирование и идентификация дрожжей.

Предварительно, 382 дрожжевых изолята (около 20 для каждой закваски) были проанализированы на способность ферментировать галактозу, сахарозу, мальтозу, раффинозу и трегалозу, а также на способность к росту при температуре 37°С. По крайней мере 6 изолятов для каждой закваски, включая все изоляты, демонстрирующие различные профили ферментации (данные не предоставлены), были генетически охарактеризованы и идентифицированы. Кластерный анализ профилей iSSR-PCR показал уровень разнообразия среди изолятов в диапазоне от 3 до 54% (данные не предоставлены). Изоляты, показывающие профили iSSR-PCR с максимальным уровнем разнообразия 10%, были сгруппированы в одном кластере. Таким образом, удалось сгруппировать 127 изолятов в 13 кластерах (I-XIII), в то время как 11 не были кластеризованы. За исключением Pane di Matera PGI, Coppia Ferrarese PGI и Pane di Cappelli, все закваски содержали изоляты, распределенные по двум или более кластерам. Штаммы были идентифицированы путем частичного анализа последовательности гена 26S рРНК (данные не предоставлены). S. cerevisiae были идентифицированы во всех заквасках, за исключением заквасок Pane di Cappelli, Pane nero di Castelvetrano, и Pagnotta del Dittaino PDO. C. humilis были идентифицированы в заквасках Pane di Terni, Pane di Cappelli и Pagnotta del Dittaino PDO. K. barnettii и K. exigua были идентифицированы в закваске Pane nero di Calstelvetrano

Статистическая корреляция между ингредиентами, технологическими параметрами, разнообразием микробных видов и биохимическими характеристиками закваски.

Источник

Микробиота желудочно-кишечного тракта собак и ее модификация про-, пре- и синбиотиками

Аннотация

Интерес к составу микробиоты кишечника и возможности ее терапевтической модификации резко возрос за последнее десятилетие, и стали доступны более подробные данные о составе микробиоты разных участков слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта собак. Пробиотики, пребиотики и их комбинация (синбиотики или симбиотики) являются способом модификации микробиоты кишечника и оказывают влияние на иммунный ответ хозяина. Пробиотики могут оказывать благотворное действие различными путями, например, продуцирование антимикробных пептидов, усиление роста благоприятных эндогенных микроорганизмов, конкуренция за место эпителиальный колонизации и иммуномодулирующие функции. Не смотря на широкое использование про-, пре- и синбиотиков, научных доказательств их положительного эффекта на собак недостаточно. Конкретные эффекты различных штаммов, их комбинаций или их потенциальные побочные эффекты оценены недостаточно. В некоторых случаях результаты in vitro были многообещающими, но не показали того же эффекта в ситуации in vivo. Специфические заболевания желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) собак или условия, при которых пробиотики были бы полезны, их наиболее подходящая дозировка и применение не были широко изучены. В этом обзоре обобщается текущие знания о составе микробиома кишечника собак и оцениваются доказательства использования пробиотиков при различных заболеваниях ЖКТ собак. Авторы обзора хотят предоставить ветеринарным врачам информацию, основанный на доказательной базе о том, когда и почему эти препараты могут быть полезны для профилактики или лечения патологий ЖКТ собак. В нем также излагаются данные о безопасности и одобрении коммерческих пробиотических продуктов и возможное использование фекальной трансплантации микробиоты у собак, поскольку они связаны с темой использования пробиотиков.

Введение

В последние годы все больше исследований было сосредоточено на характеристике микробиоты на разных участках тела у людей, что привело к реализации проекта «Микробиома человека» (The NIH HMP Working Group 2009); и был достигнут значительный прогресс в определении и понимании микробных сообществ у мелких животных, особенно при наличии методов крупномасштабного геномного секвенирования.

Естественно, обнаружение различий в характеристиках микробиоты или композиций микробиома между здоровыми и больными субъектами привело к выводу, что изменение этих микробных сообществ может оказать благотворное влияние на здоровье хозяина при определенных обстоятельствах. Именно здесь основное внимание уделяется применению пре- или пробиотиков или их комбинаций (так называемых синбиотиков (иногда используется термин симбиотики)); особенно при заболеваниях кишечника человек и собак, таких, как воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) (Sauter et al. 2006; Ghouri et al. 2014; Rossi et al. 2014; Schmitz et al. 2014, 2015a; Saez-Lara et al. 2015).

Поскольку пробиотики обычно не относят к лекарственным средствам, им не нужно проходить какой-либо процесс, доказывающий их эффективность при применении, заболеваниях или даже у конкретных видах животных. Следовательно, было озвучено множество их медицинских преимуществ как у людей, так и у животных. В этом обзоре основное внимание уделяется тому, что известно об определении, механизме действия и эффективности пробиотиков при различных заболеваниях ЖКТ у собак, и суммируются эти данные, чтобы читатель мог лучше судить о том, когда и как использовать пробиотики в гастроэнтерологии мелких домашних животных.

Состав микробных сообществ желудочно-кишечного тракта собак

Микробиом желудочно-кишечного тракта у здоровых собак

В последнее время высокопризводительные методы секвенирования ДНК улучшили идентификацию микроорганизмов у мелких животных. В основном эти методы были применены для описания филогенетической структуры и функциональной емкости микробиома ЖКТ (Handl et al. 2011; Swanson et al. 2011; Hooda et al. 2012). Некоторые исследования включали в себя образцы слизистой оболочки или кишечного содержимого различных сегментов ЖКТ (Suchodolski et al. 2009, 2010, Suchodolski et al. 2012a), но большинство из них было сосредоточено на анализе образцов фекалий, поскольку их легче получить (Garcia-Mazcorro et al. 2011; Handl et al. 2011, 2013; Swanson et al. 2011; Suchodolski et al. 2012b; Honneffer et al. 2014; Minamoto et al. 2014a). Это важно при сравнении исследований друг с другом, поскольку было показано, что популяции бактерий различаются между различными субстратами и отделами кишечника (Momozawa et al. 2011).

Очень мало известно о необходимых дозировке пробиотиков у мелких животных, не говоря даже о конкретных заболеваниях. Характеристики выживаемости пробиотических штаммов (особенно E. faecium) были протестированы in vitro и in vivo, т.е. при низком pH среды (имитация среды желудка), наличии желчи, прикреплении к слизистой, выделении живых бактерий с фекалиями у собак после перорального введения (Lauková et al. 2004, 2008; Strompfová et al. 2004a; Marciňáková et al. 2006). В целом не совсем ясно является ли выживаемость микроорганизмов пробиотиков необходимой для благоприятного эффекта или достаточно только их ДНК (Kant et al. 2014). Существует некоторые свидетельства того, что даже нежизнеспособные пробиотические бактерии могут вызвать иммунную модуляцию у хозяина (Zhong et al. 2012). Кроме того очень мало информации о возможных взаимодействиях штаммов в препаратах с комбинацией штаммов, хотя некоторые исследования на грызунах и людях демонстрируют синергический эффект (Baillon et al. 2004). Эффект формы (жидкость, капсула, в составе корма) или натуральные источники потенциальных пробиотиков (йогурт, сырой черный рубец, ферментированный растительный материал) в настоящее время в основном не изучен. Имеются некоторые предварительные данные о влиянии дачи сырого мяса, пребиотических волокон и экстракта клеточных стенок дрожжей на состав микробиоты фекалий (Beloshapka et al. 2013). Изменения в зависимости от источника белка (курица или говядина) были менее очевидными, но незначительные изменения в составе микробиоты наблюдались при добавлении пребиотиков (например, большее присутствие фузобактерий, более низкое содержание Faecalibacterium). Однако значимость этих наблюдаемых изменений остается неясной, тем более, что это исследования было проведено на здоровых собаках. Кроме того в большинстве исследований оценивались фекальные образцы и отмечались лишь незначительные изменения. Однако недавние исследования показывают, что пробиотические смеси (то есть VSL#3) способны индуцировать значительные изменения в пристеночной микробиоте в толстом кишечнике мышей и собак с хроническими энтеропатиями (Mar et al. 2014; White et al. 2015).

Контроль качества также является проблемой у пробиотических продуктов. Поскольку они, как правило, классифицируются как пищевые добавки, контроль качества как в случае лекарственных средств не требуется. Опять же нет большого количества данных о качестве, сроке годности и т.д. коммерчески доступных пробиотиков. В одном исследовании были оценены микробные компоненты корма для собак, которые, как утверждается, содержит пробиотики (Weese & Arroyo 2003). Ни одна из 19 коммерческих диет не содержала всех заявленных микроорганизмов, тогда как один или несколько перечисленных компонентов можно было выделить из примерно 50% образцов. Одиннадцать образцов содержали дополнительные, связанные организмы и более 25% тестируемых диет не показали соответствующего бактериального роста. По мнению авторов, ни одно опубликованное исследование пока не оценило, соответствует ли заявляемое количество и качество бактерий в пробиотических пищевых добавках заявкам на этикетке.

Эффект пробиотиков на отдельные параметры у здоровых собак

Enterococcus faecium

Лактобациллы и бифидобактерии

В ряде исследований были исследованы безопасность и эффект препаратов, с единственным штаммом молочнокислых бактерий у здоровых собак. Например, эффект от введения L. acidophilus на измеримые показатели был спорным. В одном из исследований его введение (L. acidophilus DSM13241) взрослы собакам было связано с изменением гематологических и иммунологических параметров (повышение эритроцитов, гематокрита, гемоглобина, нейтрофилов, моноцитов и сывороточного IgG, снижение хрупкости эритроцитов и концентрации NO в сыворотке) сомнительной клинической значимости (Baillon et al. 2004). В другом исследовании предположительно благоприятные изменения, наблюдаемые в составе метаболитов микробиоты и фекалий, были в большей степени связаны с добавлением пребиотического ФОС, чем с самим L. acidophilus NCFM (Swanson et al. 2002).

Lactobacillus animalis LA4 (выделенный из фекалий здоровой взрослой собаки) тестировали in vitro и in vivo у девяти собак (лиофилизировали, давали в течение 10 дней). На 11-й день концентрация культивируемых фекальных лактобацилл были увеличены, а энтерококков снизилась по сравнению с началом исследования, поэтому этот штамм был определен как имеющий некоторые пробиотические свойствами (Biagi et al., 2007). Однако этот вывод почти невозможно сделать, поскольку полуколичественная культура была единственным оцениваемым результатом и не было контрольной группы.

Различные штаммы Bifidobacterium animalis [AHC7; (Kelley et al., 2010) и неуточненный штамм, выделенный из собачьих фекалий (Strompfová & Lauková 2014)], были исследованы на сходных группах, и было обнаружено, что они не вызывают каких-либо нежелательных эффектов. Их введение здоровым собакам увеличивало количество культивируемых молочнокислых бактерий, но уменьшало количество бактерий кишечной палочки в фекалиях собак. Другие параметры фекалий и сыворотки, а также фагоцитарная активность лейкоцитов периферической крови (особенно нейтрофилов) были улучшены у обработанных собак по сравнению с контрольной группой. Эти эффекты обнаруживались через несколько недель после прекращения применения препарата (Strompfová et al., 2014), но опять же их значимость остается неясной, тем более, что используемые методы оценки иммунной функции были довольно грубыми.

Общие данные об улучшении здоровья кишечника или иммунологическом статусе у собак при использовании лактобацилл или бифидобактерий не являются убедительными, особенно в свете того факта, что неизвестно, коррелирует ли увеличение определенной бактериального типа с улучшением функции ЖКТ или более низкой частотой диарейных заболеваний.

Бациллы

Некоторые авторы считают, что бациллы являются превосходными пробиотики для молочнокислых бактерий, поскольку они могут образовывать споры и, следовательно, быть более устойчивыми к стрессу окружающей среды и низкому уровню pH (Biourge et al., 1998; Félix et al., 2010). Однако простое выживание может быть не самой важной особенностью пробиотика, и все они должны быть проверены на предмет их пользы в клинических ситуациях. В некоторых европейских странах пробиотические продукты, содержащие Bacilli, доступны в качестве пищевых добавок для людей и животных (Biourge et al., 1998). Было показано, что они оказывают благотворное влияние на выживаемость мышей, инфицированных Klebsiella pneumoniae, и на плодовитость ряда продуктивных животных (Biourge et al., 1998). Было установлено, что Bacillus CIP 5832 является устойчивым при добавлении к собачьему корму и при проведении экспериментов по расширению-экструзии и сушке. Они также смогли выжить в ЖКТ собак, однако, похоже, не задерживались, поскольку они исчезли из фекалий через 3 дня после прекращения введения (German et al., 2000). Только одно исследование показало, что Bacillus subtilis C-3102 может улучшить текстуру и запах фекалий у собак из-за снижения содержания фекального аммиака (Félix et al., 2010). Еще раз, клиническая значимость этого открытия и обоснование обозначения бацилл как «пробиотиков» в этой ситуации весьма сомнительны, и использование бацилл в качестве пробиотиков не может быть рекомендовано.

Пробиотические смеси

Смеси пробиотиков, используемые у здоровых собак, имеют переменный состав; кроме того, результаты были различными, в основном также из-за наличия различных методов оценки изменений в микробных сообществах. В одном исследовании вводили пять потенциально пробиотических штаммов молочнокислых бактерий (L. fermentum, L. salivarius, Weissella confuse, L. rhamnosus и L. mucosae) пяти биглям с постоянными фистулами в течение 7 дней (Manninen et al., 2006). Денатурирующий градиентный гель-электрофорез (DGGE) продемонстрировал, что молочнокислые бактерии модифицировали доминирующую местную тощекишечный молочнокислую микробиоту. Все штаммы не обнаруживались через 7 дней после прекращения приема, и эффекты были временными. В другом исследовании (Garcia-Mazcorro et al., 2011) семь штаммов молочнокислых бактерий (E. faecium, S. salivarus ssp. Thermophilus, B. longum, L. acidophilus, L. casei ssp. Rhamnosus, L. plantarum, L. Delbrueckii ssp. Bulgaricus) вводили 12 здоровым собакам, а фекальные микробные сообщества оценивали с использованием DGGE, библиотек генов 16S рРНК, количественного ПЦР и 16S рРНК 454-пиросеквенирования. Пробиотические виды обнаруживались у 11/12 собак во время введения продукта, но не раньше или позже. Содержание энтерококков и стрептококков spp. было значительно увеличено. Однако при пиросеквенировании не наблюдалось никаких изменений в основных бактериальных типах. Это исследование показало, что продукт хорошо переносится и не вызывает каких-либо клинических побочных эффектов. Введение продукта приводило к увеличению обилия пробиотических видов, но этого было недостаточно, чтобы вызвать значительные изменения в общей структуре микробиома (Garcia-Mazcorro et al., 2011) и, конечно же, автоматически нельзя делать вывод о пользе для здоровья.

Наконец, в плацебо-контролируемом исследовании на здоровым ездовых собаках, которым был введен синбиотик, состоящий из E. faecium SF68, Bacillus coagulans, L. acidophilus и нескольких пребиотиков (FOS, MOS) и витаминов (B3, B6), оценивались изменения композиции фекальной микробиоты с использованием количественной ПЦР и tag-encoded FLX пиросеквенирования ампликонов генов 16S рДНК (Gagné et al., 2013). Изменения в фекальном микробиоме включали рост Lactobacillaceae и повышенную концентрацию фекальных бутиратов у всех собак. Качество фекалий также улучшились по сравнению с контрольной группой через 5 недель (Gagné et al., 2013). Являются ли эти данные коррелирующими, полезными для хозяина или только случайными, остаются неясными.

Использование пробиотиков при желудочно-кишечных заболеваниях у мелких домашних животных

Инфекционная и неинфекционная острая диарея

В целом, кажется, что, возможно, есть некоторые преимущества в использовании пробиотиков (в зависимости от штамма или используемой смеси) при острых инфекционных заболеваниях ЖКТ у собак. Введение пробиотической смеси VSL#3 рандомизированным образом щенкам с подтвержденным парвовирусным энтеритом приводит к увеличению процента выживших собак (90% в группе пробиотиков против 70% в группе, не получавшей пробиотики) и более быстрое улучшение клинических показателей и числа лейкоцитов / лимфоцитов (Arslan et al., 2012). В другом исследовании наблюдалось значительное снижение количества яиц Ancylostoma у 10 собак, которым скармливали смесь молочнокислых бактерий (L. acidophilus ATCC 4536, L. plantarum ATCC 8014 и L. delbrueckii UFV H2B20) в течение 28 дней, по сравнению с контрольной группой (Coêlho et al., 2013). Аналогичные результаты не были достигнуты при лечении лямблиоза собак с помощью E. faecium SF68: после 6 недель лечения не наблюдалось различий в выделении цист, фекальных антигенов, фекального IgA или фагоцитарной активности лейкоцитов между обработанными и необработанными собаками (Simpson et al. 2009).

Хроническая диарея

Как и у людей, предполагается, что патогенез хронических воспалительных состояний ЖКТ у собак (например, хроническая энтеропатия / ВЗК) связан с аберрантным ответом иммунной системы на просветную или прилегающую кишечную микробиоту (Sartor 2006; Hall & German 2010). Имеются достаточные доказательства иммунной дисрегуляции, хотя точный тип воспалительной реакции и патогенеза еще не выяснен (German et al., 2000; Peters et al., 2005; Jergens et al., 2009; Schmitz et al., 2012). В нескольких исследованиях показано, что имеются также изменения микробиома кишечника, присутствующие у собак с хронической энтеропатией / ВЗК (Suchodolski et al., 2012a, b). Следовательно, было несколько попыток повлиять на состав микробиоты у этих собак, чтобы облегчить клинические признаки; частично используя пробиотики, которые уже показали, что имеют некоторые иммуномодулирующие свойства в исследованиях in vitro или ex vivo (Sauter et al., 2005, 2006; Schmitz et al., 2013, 2014). Оценивалось влияние однократной обработки E. faecium NCIMB 10415 E1707 собак с диареей, чувствительной к корму (FRD), и обнаружилось, что это не влияет на оценку клинической активности, результаты гистологии двенадцатиперстной и толстой кишки или экспрессию отдельных генов, связанных с конкретными линиями Т-хелперных лимфоцитов (Schmitz et al., 2015b). Кроме того, также не было эффекта применения E. faecium на экспрессию генов или белков воспалительных соединений (Schmitz et al., 2015b). Более перспективные результаты могут быть достигнуты за счет использования пробиотических смесей у собак с FRD: комбинация молочнокислых бактерий (L. acidophilus и L. johnsonii) уменьшала уровни дуоденального интерлейкина (IL)-10 и толстокишечного интерферона (IFNγ) мРНК и количество фекальных Enterobacteriaceae, тогда как число Lactobacillus spp. возросло. Схожие клинические улучшения были отмечены у собак, получавших коктейль молочнокислых бактерий, по сравнению с собаками, получавшими только диету (Sauter et al., 2005).

Кроме того в открытом исследовании при лечении собак с идиопатическим ВЗК сравнивалось использование пробиотической смеси VSL#3 для домашних животных (SIVOY ™, подробности выше) и применение метронидазола и преднизолона (Rossi et al., 2014). Клиническая активность, показатели гистологии двенадцатиперстной кишки и CD3 + лимфоцитов в кишечной ткани сократили восстановление в обеих группах. Тем не менее, число клеток FoxP3+ (маркер регуляторных Т-хелперных лимфоцитов [Tregs]) значительно увеличилось только у собак, получавших штаммы VSL#3. Кроме того, количество клеток трансформирующего ростового фактора бета (TGFb)+ (скорее всего, Tregs) увеличилось в обеих группах после лечения, но до большей величины у собак, обработанных пробиотиками. Наблюдалось некоторое влияние пробиотиков на экспрессию белков с плотным соединением, при этом окклюдин значительно повышался у здоровых контрольных собак и собак, получавших пробиотики по сравнению с собаками с ВЗК. Анализ микробиома, основанный на количественной ПЦР, выявил снижение численности Faecalibacterium и Turicibacter у собак с ВЗК в начале исследования с существенным увеличением Faecalibacterium, наблюдаемым у животных, получавших VSL#3 (Rossi et al., 2014). Это примечательно, так как Faecalibacterium prausnitzii рекомендуется как противовоспалительная комменсальная бактерия у людей (Miquel et al., 2013) и имеет более низкое содержание в содержимом кишечника или фекальных образцах от пациентов с ВЗК, как людей, так и собак (Suchodolski et al., 2012b; Fujimoto et al., 2013).

Фекальные микробные трансплантаты

Заключение

Микробиота на поверхностях слизистой оболочки, особенно в желудочно-кишечном тракте, у собак сложна. Состав варьируется в зависимости от локализации, и есть некоторые свидетельства того, что изменения в составе микробиоты / микробиома связаны с определенными заболеваниями. Однако анализ состава микробиоты ЖКТ и фекалий собак, его функций, производство метаболитов и иммунологических свойств далеко не завершен, хотя данные о микробиоме накапливаются. Соответственно, все знания о лучших характеристиках микробных комменсалов или пробиотиков для собак являются неоднородными, и большинство предположений об их свойствах получены из исследований у человека. Есть некоторые бактериальные штаммы, которые демонстрируют перспективность как потенциальные пробиотики, особенно молочнокислые бактерии. Однако эффекты наиболее часто используемого штамма (E. faecium) до сих пор не совсем понятны, особенно у больных собак. Нелегко сравнивать результаты различных исследований как у здоровых, так и у больных собак, так как существуют огромные различия в применяемых пробиотиках (одноштаммные, многоштаммные, по типу микроорганизмов), их дозировка, форме и частота применения. Измеренные результаты также несовместимы. В целом авторы считают, что E. faecium более подходит для острых и / или инфекционных форм диареи; поскольку есть некоторые свидетельства того, что он вызывает более про-воспалительную, а не противовоспалительную реакцию (Schmitz et al., 2014, 2015b); тогда как некоторые лактобактерии и бифидобактерии проявляют более выраженные иммуномодулирующие функции. Интригующе, особенно сочетание молочнокислых бактерий (VSL#3), используемое в медицине для профилактики рецидива язвенного колита, имеет некоторые перспективы в лечении хронических энтеропатий у собак и в создании более противовоспалительной местной среды (Rossi et al., 2014). Интересно отметить, что даже при четко определенных инфекционных заболеваниях, таких как парвовиоз или паразитарное заражение, некоторые пробиотики оказывают благотворное влияние. Механизм этого недостаточно изучен, и необходимы дальнейшие исследования. Из исследований у людей и экспериментальных данных на грызунах известно, что иммунологический исход зависит как от бактериального штамма, так и от подвида, вероятно, зависит от дозы (Weese & Anderson 2002, Evrard et al., 2011; Garcia-Mazcorro et al. 2011) — и иммунный ответ соответствующего хозяина. У людей пробиотики были отнесены к «провоспалительным» и «противовоспалительным» препаратам у некоторых авторов в зависимости от их основных свойств (Shida et al., 2011). Из-за этого необходима тщательная оценка потенциальных пробиотиков у целевых видов и болезней — возможно, как in vitro, так и in vivo — чтобы судить об их полном потенциале. Некоторые авторы даже предлагают сначала протестировать все пробиотики in vitro или в эксплантатах ткани, прежде чем выполнять исследования in vivo (Tsilingiri et al., 2012). Однако это не всегда возможно в ветеринарной медицине.

Также следует учитывать, что бактерии не всегда могут быть наиболее подходящими пробиотиками. Мы практически ничего не знаем о грибном или даже вирусном составе нормального кишечного тракта или других поверхностях слизистых оболочек у собак (Foster et al., 2013). Имеются некоторые свидетельства того, что дрожжи, такие как Saccharomyces boulardii, могут быть действительными альтернативными пробиотиками и нуждаются в более подробных исследованиях. Кроме того, новая область — это исследование метаболитов бактерий (например, индола, ацетата), которые потенциально могут служить постбиотиками.

Трансплантация фекалий является интересным вариантом лечения как острой, так и хронической диареи у собак, однако многое еще нужно понимать в отношении ее наилучшей производительности, безопасности и полезности, прежде чем ее можно будет рекомендовать в качестве обычного лечения.

Таким образом, необходимо сделать больше работы, чтобы понять сложное взаимодействие между потенциальными пробиотиками и средой их хозяина. Очень тщательное исследование механизмов действия и подробное измерение результатов поможет понять, какой пробиотик полезен при каком состоянии, и какие изменения микробиома кишечника необходимы для достижения клинической ремиссии как острых, так и хронических состояний.

Источник